Dos isoformas de amida hidrolasa de ácidos grasos de leguminosas con distintas preferencias por microbios

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7486 (2023) Citar este artículo

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La amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) es una amidasa ampliamente conservada en eucariotas, quizás mejor conocida por inactivar los mediadores lipídicos de N-aciletanolamina. Sin embargo, las enzimas FAAH hidrolizan una amplia gama de sustratos de acilamida. El análisis de FAAH de múltiples especies de angiospermas reveló dos grupos filogenéticos conservados que diferían en residuos clave conservados en el bolsillo de unión al sustrato. Si bien el grupo base de FAAH de plantas, denominado FAAH1, se ha estudiado a nivel estructural y funcional en Arabidopsis thaliana, no se sabe nada sobre los miembros de FAAH2. Aquí, combinamos enfoques computacionales y bioquímicos para comparar las propiedades estructurales y enzimáticas de dos isoformas FAAH en la leguminosa Medicago truncatula denominada MtFAAH1 y MtFAAH2a. Las diferencias en las propiedades estructurales y fisicoquímicas de los bolsillos de unión del sustrato, predichas a partir de modelos de homología, acoplamiento molecular y experimentos de simulación de dinámica molecular, sugirieron que estas dos isoformas FAAH exhibirían diferencias en sus perfiles de actividad de amidohidrolasa. De hecho, los estudios cinéticos de MtFAAH recombinantes purificados indicaron una preferencia recíproca por los sustratos de acilamida con MtFAAH1 utilizando de manera más eficiente acilamidas de cadena larga, y MtFAAH2a hidrolizando de manera más eficiente acilamidas aromáticas y de cadena corta. Este primer informe del comportamiento enzimático de dos FAAH de plantas filogenéticamente distintas proporcionará una base para futuras investigaciones sobre las isoformas de FAAH en leguminosas y otras especies de plantas.

La amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) es una amidasa conservada que hidroliza las N-aciletanolaminas (NAE) lipofílicas en etanolamina y ácidos grasos libres1,2,3,4. Por ejemplo; los FAAH de rata, ratón y humanos hidrolizan la anandamida endógena (NAE20:4) en ácido araquidónico y etanolamina5,6. En los mamíferos, este proceso está relacionado con una variedad de procesos neurológicos y fisiológicos que van desde la percepción del dolor hasta la regulación de la dieta7,8. En otro ejemplo, el FAAH recombinante derivado de la planta de musgo, Physcomitrella patens, también pudo hidrolizar NAE20:4 en productos correspondientes, que parecían estar asociados con el crecimiento y desarrollo de las especies de musgo9. En otro lugar, se demostró que C. elegans posee una enzima FAAH que metaboliza NAE20:4 para apoyar la regulación de la longevidad10. Estos y muchos otros informes han demostrado una maquinaria FAAH ampliamente conservada en múltiples especies para la regulación de NAE en varios procesos biológicos.

En la planta modelo, Arabidopsis thaliana, los estudios in vitro e in vivo demostraron que A. thaliana FAAH (AtFAAH) puede escindir el enlace amida de los NAE endógenos, incluidos los saturados (p. ej., NAE12:0), monosaturados (p. ej., NAE18:1) y especies poliinsaturadas (p. ej., NAE18:3), así como oxilipinas NAE derivadas de 9-LOX (9-hidroxi linoleoiletanolamida; NAE-9-HOD)1,11,12,13. La regulación de los contenidos de NAE por FAAH parece estar asociada con una variedad de procesos biológicos14. Por ejemplo, en Arabidopsis, las líneas que sobreexpresan AtFAAH tenían cantidades más bajas de NAEs endógenos y mostraron mayores diferencias en el crecimiento de las plántulas15, el tiempo de floración16 y la inmunidad innata17, en comparación con las plantas de tipo salvaje. Por el contrario, Arabidopsis faah-knockouts tenían contenidos elevados de NAE endógenos y eran hipersensibles a la inhibición del crecimiento inducida por aplicaciones externas con NAE (p. ej., NAE12:0 o NAE18:2)15,18,19, alcamidas20,21, N-acil homoserina lactonas (AHLs)22, o la fitohormona ABA13. En otro informe, las plántulas de algodón americano (Gossypium hirsutum L.) con sobreexpresión ectópica de AtFAAH mostraron insensibilidad a NAE12:0 o al hidróxido derivado de NAE18:2 (NAE-9-HOD), lo que se asemeja a los resultados encontrados en Arabidopsis23. Estos informes sugieren que la regulación del contenido de N-aciletanolamida por FAAH puede influir en una serie de procesos fisiológicos en las plantas.

Las N-acil-ʟ-homoserina lactonas (AHL) o las N-aril-ʟ-homoserina lactonas (aril-HL) son lípidos derivados de bacterias que se utilizan en procesos de comunicación de célula a célula (detección de quórum; QS) (por ejemplo, biopelícula producción) o interacciones con un huésped (p. ej., reconocimiento de bacterias simbióticas o patógenas)24,25,26. Debido a las similitudes estructurales entre NAE y estas moléculas QS (grupo de cabeza polar con una cola de acilo unida a amida), se planteó la hipótesis de que las FAAH de plantas podrían hidrolizar AHL y aril-HL22. Otros experimentos revelaron que AtFAAH recombinante hidroliza los AHL de cadena acilo larga como OdDHL (N-(3-oxododecanoil)-ʟ-homoserina lactona) u OtDHL (N-(3-oxotetradecanoil)-ʟ-homoserina lactona) mejor que los AHL con cadenas más cortas. como OHHL (N-(3-oxohexanoil)-ʟ-homoserina lactona)22, lo que indica que la actividad de AtFAAH puede verse influenciada por la longitud/naturaleza de la cadena de acilo en el sustrato. En el mismo experimento, el aril-HL, p-cumaril-HL fue un sustrato pobre para AtFAAH22. Además, se demostró que los AHL desencadenan una respuesta de crecimiento "bifásica" en las plántulas de A. thaliana. En sus experimentos, las plántulas de Arabidopsis de tipo salvaje alimentadas con AHL mostraron fenotipos de crecimiento mejorados o reducidos a concentraciones bajas (p. ej., 0,1 µM) o elevadas de AHL (p. ej., 100 µM), respectivamente22. Luego, las comparaciones lado a lado con los knockouts faah de Arabidopsis revelaron que dicha sensibilidad se puede modular de una manera dependiente de FAAH, es decir, se requirió la hidrólisis de AHL por FAAH para la modulación de la señal de crecimiento22.

Las alcamidas son amidas de ácidos grasos de origen fúngico o vegetal21,27,28 y constituyen otro grupo de moléculas similares a NAE que se han asociado con la hidrólisis mediada por FAAH20. En Arabidopsis de tipo salvaje, las aplicaciones exógenas de la alcamida, afinina (grupo de cabeza de N-isobutilo y cadena de acilo) dieron como resultado un efecto "bifásico" que se parecía al de las AHL (ver arriba). De hecho, las plántulas de Arabidopsis de tipo salvaje alimentadas con afinina en concentraciones por debajo de 28 µM tenían raíces primarias que eran más largas que los controles21. Por el contrario, la afinina en concentraciones superiores a 28 µM condujo a un desarrollo radical notablemente afectado21. En otro estudio, los sobreexpresadores de FAAH de Arabidopsis o los knockouts de faah demostraron que la susceptibilidad a la alcamida se moduló a través de la hidrólisis de FAAH20. Curiosamente, la actividad in vitro de AtFAAH hacia la afinina u otras 12 alcamidas de varias longitudes de cadena de acilo y grupos de cabeza de alquilo fue mucho más inferior en comparación con la hidrólisis de NAEs20 por AtFAAH. No obstante, estos informes respaldan una conexión entre la hidrólisis FAAH de alcamidas y los efectos en el crecimiento de las plantas.

FAAH se caracteriza por la presencia de una tríada catalítica Ser-Ser-Lys conservada1,29,30. Las N-acilamidas que alcanzan el sitio activo en el canal de unión acilo (ABC) forman un intermediario covalente entre el sustrato y la enzima. Esto se logra mediante la activación de la serina catalítica (nucleófilo) que ataca el carbono del grupo carbonilo en el sustrato31. Las FAAH de mamíferos y plantas parecían tener distintos mecanismos para la unión al sustrato. Por ejemplo, se propone que AtFAAH experimente cambios conformacionales que conducen al movimiento de una región helicoidal (residuos 531–537) y al cierre de su canal de acceso a la membrana (MAC), mediante un proceso denominado "apretar y bloquear"1. Por el contrario, en la FAAH de rata, el complejo ligando-enzima está asegurado por una "paleta dinámica" que cierra su MAC más estrecha y "atrapa" el sustrato en el sitio activo. En ambos casos, luego de la catálisis FAAH, la etanolamina se libera al citosol a través del canal de acceso citosólico (CAC), mientras que el producto de ácido graso se libera nuevamente al entorno hidrofóbico de la bicapa de la membrana1,29. Las estructuras cristalinas resueltas de FAAH de plantas y mamíferos han proporcionado información sobre componentes estructurales y funcionales clave que podrían usarse como referencia para FAAH de otros organismos.

Recientemente, la comparación de 88 secuencias de aminoácidos FAAH de diversas especies de angiospermas reveló dos grupos filogenéticos principales, FAAH1 y FAAH232. Las especies de plantas de la familia Brassica como A. thaliana o Camelina sativa exhibieron solo una isoforma FAAH (FAAH1), mientras que todas las especies de dicotiledóneas y monocotiledóneas, incluida Amborella trichopoda (la "especie ancestral de angiospermas") tenían ambos grupos FAAH, y muchas tenían más de un miembro32. Por ejemplo, el tomate (Solanum tuberosum) tiene tres isoformas FAAH1 y una FAAH2, mientras que el arroz (Oryza sativa) tiene una isoforma FAAH1 y dos FAAH232. El análisis de múltiples alineaciones de secuencias mostró cambios de residuos en las regiones correspondientes al bolsillo de unión al sustrato de las isoformas FAAH1 y FAAH2. El modelo de homología de FAAH de soja (Glycine max) reveló diferencias estructurales y químicas adicionales entre FAAH1 y FAAH232 de soja. Se planteó la hipótesis de que estas diferencias influyen en la selectividad de sustrato de las enzimas FAAH1 y FAAH2, y además sugieren que las FAAH pueden haber desarrollado distintas maquinarias FAAH para modular un repertorio ampliado de lípidos de señalización lipofílicos32,33. Aunque conceptualmente esta noción parece plausible, hasta el momento, se carece de evidencia experimental para respaldar esta hipótesis, en gran parte porque no hay información bioquímica relacionada con el grupo de enzimas FAAH2. Aquí, abordamos esta brecha en el conocimiento mediante la combinación de enfoques computacionales y bioquímicos para estudiar y caracterizar dos FAAH de la leguminosa Medicago truncatula, MtFAAH1 y MtFAAH2a, y proporcionamos evidencia de que estas dos isoformas tienen preferencias de sustrato recíprocas.

Para examinar la diversidad de FAAH dentro de las leguminosas, comparamos las secuencias de aminoácidos de FAAH de diez especies seleccionadas utilizando AtFAAH (una enzima FAAH1) como referencia (Fig. 1a; Tabla complementaria S1). Los datos mostraron que estas FAAH de leguminosas se agruparon en dos grupos principales, designados como FAAH1 y FAAH2 (Fig. 1a). Solo se identificó una isoforma FAAH1 en cada especie de leguminosa. En particular, FAAH2 formó dos subgrupos en la mayoría de las especies, FAAH2a y FAAH2b. Con excepción de G. max y Vigna radiata, el resto de las leguminosas (incluida M. truncatula) presentaron dos isoformas FAAH2. En comparación con el miembro fundador de FAAH1, AtFAAH, los porcentajes de similitud de secuencia de aminoácidos para MtFAAH1, MtFAAH2a o MtFAAH2b fueron aproximadamente 66 %, 44 % y 44 %, respectivamente (Figura complementaria S1; Tabla complementaria S2).

Análisis de secuencias y modelos de homología de FAAH de Medicago truncatula, a saber, MtFAAH1 y MtFAAH2a. ( a ) Análisis filogenético de secuencias de aminoácidos de FAAH de 10 especies de leguminosas diferentes. La secuencia FAAH (AtFAAH) de A. thaliana también se incluyó en el análisis, como control FAAH1. Los asteriscos indican las secuencias de MtFAAH que se investigaron más a fondo en este estudio. ( b ) Modelos de homología de MtFAAH1 y MtFAAH2a (panel superior). El canal de acceso a la membrana (MAC) y la tapa de unión a la membrana (MBC) están etiquetados en las estructuras. Se incluye una vista de 90° de los mismos modelos (panel inferior) para fines de visualización. El dominio de firma de amidasa (AS) de AtFAAH (púrpura) se superpuso con (c) AS de MtFAAH1 (verde) o (d) AS de MtFAAH2a (amarillo). Se presenta una vista de cerca de sus residuos de la tríada catalítica tanto para (c) como para (d).

La inspección de los perfiles de expresión de la transcripción de MtFAAH1, MtFAAH2a y MtFAAH2b en el Atlas de expresión génica de Medicago truncatula "MtExpress"34 mostró que MtFAAH1 o MtFAAH2a se expresaron altamente en diferentes tejidos, condiciones de temperatura, puntos temporales, estrés abiótico (p. ej., inanición de N) y estrés biótico (p. ej., exposición al hongo micorrícico arbuscular Rhizophagus irregularis), mientras que en las mismas condiciones MtFAAH2b se expresó a un nivel mucho más bajo (Fig. S2 complementaria). Con base en estos datos, seleccionamos MtFAAH1 y MtFAAH2a para un análisis posterior con enfoques computacionales y bioquímicos.

Los modelos de homología de MtFAAH1 y MtFAAH2a se predijeron en función de la estructura cristalina de AtFAAH (PBD: 6DHV) para comparar sus características estructurales (Fig. 1b). La calidad de los modelos MtFAAH1 y MtFAAH2a fue respaldada con puntajes GMQE (Estimación de calidad del modelo global) (0.90 para MtFAAH1 y 0.80 para MtFAAH2a), puntajes QMEANDisCo (restricción de distancia basada en consenso Qmean) (0.88 para MtFAAH1 y 0.79 para MtFAAH2a) y Puntuaciones de Ramachandran (Ramachandran favorecido; 95,59 % para MtFAAH1 y 94,31 % para MtFAAH2a) (Figuras complementarias S3, S4; Tabla complementaria S3, S4). Ambos modelos se muestran como homodímeros (Fig. 1b) con un contenido general predicho similar y una organización de hélices alfa, hojas beta, giros y bobinas no estructuradas (Fig. S5 complementaria). Tanto MtFAAH1 como MtFAAH2a han conservado tapas de unión a membrana (MBC) y canales de acceso a membrana (MAC) en sus terminales N (Fig. 1b, Fig. S6 complementaria), que se prevé que anclen FAAH a la membrana1. Al igual que en la estructura cristalina de AtFAAH, los MBC de ambos MtFAAH se caracterizan por una prevalencia de residuos hidrofóbicos (Fig. S6 complementaria). Como era de esperar, el dominio de firma de amidasa (AS) de AtFAAH se caracteriza por la presencia de una tríada catalítica Ser-Ser-Lys como en otros miembros de la familia FAAH, y estos residuos se conservan aquí en MtFAAH1 y MtFAAH2a (Fig. 1c, d) . En conjunto, estos datos destacan la conservación de la asociación de membrana predicha y los residuos del sitio activo para MtFAAH1 y MtFAAH2a.

Anteriormente, un informe destacó varias diferencias de residuos clave que alteraron la forma y las propiedades previstas de los bolsillos de unión al sustrato (SBP) de la soja FAAH1 y FAAH232. Para corroborar que tales hallazgos se conservan en una especie de leguminosa diferente, analizamos los SBP de M. truncatula FAAHs, MtFAAH1 y MtFAAH2a. Los datos revelaron múltiples diferencias de residuos, especialmente dentro de los canales de acceso citosólico (CAC) y unión de acilo (ABC) (Fig. 2; Tabla complementaria S5). El CAC de MtFAAH1 tiene varios aminoácidos polares (p. ej., Thr299, Glu337), mientras que estos residuos en el CAC de MtFAAH2a son aminoácidos no polares (p. ej., Val306, Trp341) (Fig. 2a-e). Además, MtFAAH1 ha colocado el residuo menos voluminoso, Gly334 en su CAC, lo que parecía proporcionar una cavidad más abierta en comparación con la de su contraparte FAAH2 (Fig. 2a-e). Por el contrario, MtFAAH2a tiene el gran residuo aromático, Trp341 en su CAC, y esto da como resultado un CAC más restrictivo (Fig. 2a-e). El ABC de MtFAAH1 se caracteriza por residuos no polares/hidrofóbicos como Leu441, Phe475, Met531, mientras que en MtFAAH2a esos residuos han sido reemplazados por tres residuos de tirosina (Tyr444, Tyr477 y Tyr533) que proporcionan entornos más neutros, polares y aromáticos (Fig. 2a–e). Además, los residuos de tirosina en MtFAAH2a dieron como resultado un ABC más cerrado y más corto (Fig. 2a-e). Por el contrario, los residuos en MtFAAH1 produjeron un ABC más abierto, como se muestra en sus perfiles de superficie hidrofóbica y aromática (Fig. 2d, e), más similar al ACB de AtFAAH11. En particular, varios de los residuos encontrados en los SBP de MtFAAH1 o MtFAAH2 se conservan entre los grupos FAAH1 o FAAH2 de múltiples especies de leguminosas (Fig. S7 complementaria). Juntos, estos datos sugieren que MtFAAH1 y MtFAAH2a tienen propiedades estructurales y fisicoquímicas distintas en sus SBP. Por lo tanto, es probable que estos diferentes SBP se adapten a diferentes estructuras de acilamida.

Los bolsillos de unión al sustrato (SBP) de MtFAAH1 y MtFAAH2a revelan diferentes perfiles estructurales y fisicoquímicos. Se muestran los residuos que se predijo que serían diferentes en los SBP de (a) MtFAAH1 (barras de color cian) o (b) MtFAAH2a (barras de color naranja). La lista completa de residuos previstos para formar los SBP de ambos MtFAAH se puede encontrar en la Tabla complementaria S3. ( c ) Alineación parcial entre las secuencias de aminoácidos de MtFAAH1 y MtFAAH2a. Las flechas que apuntan a los residuos en fuentes cian o naranja representan residuos distintos en el SBP de MtFAAH1 o MtFAAH2a, respectivamente. (d) Las superficies aromáticas de los residuos resaltados en (a), (b) y (c) revelan diferentes perfiles aromáticos. La escala aromática describe las conformaciones de borde (azul) a cara (naranja) de residuos con una cadena lateral aromática. (e) Perfiles superficiales de hidrofobicidad para los residuos resaltados en (a), (b) y (c). La escala de hidrofobicidad varía de 3,00 para las regiones hidrofóbicas más altas (marrón) o − 3,00 para las regiones hidrofóbicas más bajas (azul).

Para probar cómo las diferencias en los SBP de MtFAAH1 y MtFAAH2a podrían alterar la unión y acomodación del sustrato, llevamos a cabo experimentos de acoplamiento molecular (Fig. 3). Para estabilizar geométricamente tanto MtFAAH1 como MtFAAH2a antes de los experimentos de acoplamiento, realizamos simulaciones dinámicas moleculares (MDS) de las formas apo de MtFAAH1 y MtFAAH2a durante 100 ns. Las trayectorias MD resultantes se estudiaron a través de cálculos de Desviación cuadrática media (RMSD) y Fluctuación cuadrática media (RMSF). Ambos MtFAAH parecían estables durante toda la simulación con valores RMSD de aproximadamente 1,5 a 1,7 Å para MtFAAH1 y 1,8 a 2,2 Å para MtFAAH2a (Fig. S8 complementaria). Los valores de RMSF mostraron perfiles de fluctuación similares para ambos MtFAAH, excepto por una región de secuencia en MtFAAH2a compuesta por los residuos 366–387 donde se observó una mayor fluctuación en comparación con MtFAAH1 (Fig. S8 complementaria).

Acoplamiento molecular de la subunidad A de MtFAAH1 o MtFAAH2a con diferentes N-acilamidas. Las estructuras 2D de ocho ligandos potenciales para MtFAAH se dibujaron utilizando el software ChemDraw (Molecular Editor) (a). De los ocho candidatos a ligando, seleccionamos tres para experimentos de acoplamiento, a saber, NAE18: 2, NAE12: 0 y p-coumaryl-HL. Apo MtFAAH1 y MtFAAH2a se sometieron a simulaciones de dinámica molecular (MDS) (durante 100 ns) antes de todos los experimentos de acoplamiento. Vistas más amplias y de primer plano de NAE18:2 (b, c), NAE12:0 (d, e) o p-coumaryl-HL (f, g) acopladas en MtFAAH1 o MtFAAH2a. Los enlaces covalentes se representan como líneas cian entre los oxígenos de la cadena lateral de los residuos catalíticos de MtFAAH1 (Ser304) o MtFAAH2a (Ser311) y el carbono del grupo carbonilo en los sustratos. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas azules, mientras que las interacciones hidrofóbicas (van der Waals) se indican como líneas discontinuas grises entre los átomos que interactúan. Los números que se muestran en los enlaces representan distancias (Å) entre los puntos de contacto. Abreviaturas: bolsillo de unión de sustrato (SBP).

Para los estudios de acoplamiento, se compararon tres acilamidas estructuralmente diferentes (Fig. 3a): NAE18:2, NAE12:0 o p-coumaryl-HL. Los modelos de homología MtFAAH1 o MtFAAH2a estabilizados por MD se acoplaron con estos tres ligandos (Fig. 3b-g). El acoplamiento reveló el potencial de enlaces covalentes entre el oxígeno de la cadena lateral (Oγ) de Ser304 o Ser311 y el carbono del grupo carbonilo de los sustratos con distancias de enlace que oscilaban entre 2,1 y 2,6 Å. Los grupos de cabeza de etanolamina polar de NAE (NAE18: 2 o NAE12: 0) estaban respaldados por múltiples enlaces de hidrógeno en los SBP de MtFAAH1 (Fig. 3b, d) y MtFAAH2a (Fig. 3c, e); esto implica residuos como Gly301, Gly254, Thr299 y Asp206 en MtFAAH1, y residuos como Gly308 y Gly309 en MtFAAH2a. La inspección de MtFAAH unidas a p-coumaryl-HL reveló algunas similitudes y diferencias interesantes. Tanto MtFAAH1 como MtFAAH2a requerían residuos de glicina (Gly301 para MtFAAH1 y Gly308 para MtFAAH2a) para el enlace de hidrógeno con el grupo principal de p-coumaryl-HL (Fig. 3f, g). Sin embargo, el grupo de cabeza de la homoserina lactona (HL) de p-cumaril-HL fue mucho más respaldado en el SBP de MtFAAH2a con enlaces de hidrógeno adicionales mediados por Glu213, Met345 y Val306. Además, MtFAAH1 posicionó a Thr299 para interacciones de enlaces de hidrógeno con p-cumarilo -Grupo de cabeza HL, mientras que MtFAAH2a tenía la cadena lateral aromática de Trp341 y el bucle de pirrolidina de Pro338 para interacciones hidrofóbicas con la cabeza HL (Fig. 3f, g). Estos datos indican una organización similar de los residuos de la tríada catalítica para lograr la catálisis, y sugieren interacciones similares y distintas para estabilizar las diferentes "regiones de cabeza" polares de los sustratos en los sitios activos de MtFAAH.

El análisis de las interacciones entre las cadenas de acilo de NAE o p-coumaryl-HL y los residuos de SBP de MtFAAH reveló ciertas similitudes y diferencias. La cadena de acilo de NAE18:2 está respaldada en MtFAAH1 por interacciones hidrofóbicas con Leu441 y una matriz de tres residuos de treonina (Thr257, Thr258, Thr529). El posicionamiento geométrico de estos residuos en MtFAAH1 parece proporcionar un entorno flexible para el alojamiento de largas cadenas de acilo (Fig. 3b; Fig. S9 complementaria) similar al informado para AtFAAH11. La unión de NAE18: 2 en MtFAAH2a fue respaldada por interacciones hidrofóbicas predichas con Thr264, Ile447, Ile540 y dos residuos de tirosina, Tyr533 y Tyr444 (Fig. 3c). En comparación con MtFAAH1, la superficie del bolsillo de unión de MtFAAH2a parecía tener una forma diferente para adaptarse a NAE18: 2 (Fig. 3c; Fig. S9 complementaria). Parece que la cadena de acilo de NAE18: 2 puede estar estructuralmente más comprimida en MtFAAH2a, presumiblemente, para ajustarse a un SBP de tamaño más restrictivo en MtFAAH2a (Fig. 3c; Fig. S9 complementaria). La cadena de acilo de la NAE más corta (NAE12: 0) acoplada en MtFAAH1 o MtFAAH2a está respaldada en ambos casos por interacciones de van der Waals con el aminoácido alifático isoleucina (Ile444 para MtFAAH1 o Ile540 para MtFAAH2a) (Fig. 3d,e). Además, MtFAAH2a ha posicionado el residuo aromático tirosina (Tyr533) para interacciones en las posiciones C11 y C12 de la cola NAE12: 0, mientras que MtFAAH1 muestra Leu441 para interacciones en C10 de la cadena de acilo de NAE (Fig. 3d, e). A diferencia de MtFAAH1, MtFAAH2a parece poseer una superficie más aromática para acomodar NAE12: 0 en su SBP (Fig. 3d, e; Fig. S9 complementaria). Finalmente, MtFAAH1 acomoda p-coumaryl-HL por interacciones predichas de van der Waals entre Thr257 y la cola aromática del aril-HL (Fig. 3f) mientras que MtFAAH2a, además de las interacciones con residuos similares (Ile447), también ha posicionado un residuo aromático , Tyr477, para enlaces de hidrógeno adicionales e interacciones π-π con el resto acilo fenólico de p-coumaryl-HL (Fig. 3g; Fig. S9 complementaria). Estos datos sugieren que MtFAAH1 o MtFAAH2a pueden acomodar NAE o aril-HL a través de residuos con distintas propiedades fisicoquímicas. De hecho, MtFAAH1 parece utilizar generalmente residuos hidrófobos con cadenas laterales alifáticas, mientras que MtFAAH2a se basa constantemente en residuos neutros con cadenas laterales aromáticas.

Para diseccionar aún más los residuos y mecanismos adicionales que podrían estar potencialmente involucrados en la acomodación de sustratos en MtFAAH, llevamos a cabo una simulación dinámica molecular (MDS) en MtFAAH1 o MtFAAH2a acoplada con NAE18: 2 o p-coumaryl-HL durante 100 ns (Figs. 4, 5; Figuras complementarias S10, S11; Tabla complementaria S6; Videos complementarios 1–12). Las trayectorias de MDS para MtFAAH1 y MtFAAH2a revelaron que NAE18: 2 o p-coumaryl-HL se pueden acomodar a través de distintas interacciones predichas.

Simulaciones de dinámica molecular (MDS) de la subunidad A de MtFAAH1 unida a NAE18: 2 (a, c) o p-coumaryl-HL (b, d). "0 ns" corresponde a los complejos equilibrados (naranja), "10 ns" y "100 ns" representan complejos procesados ​​por MDS en 10 (púrpura) y 100 ns (verde). Vistas más amplias y de primer plano de las regiones de las hélices (residuos 530–536) que se muestran como dibujos animados y palos superpuestos, bolsillo de unión al sustrato (SBP) con ligandos (esferas) y residuos superpuestos (palos) elegidos de experimentos de acoplamiento, y hélices α1 y α2 predichas se muestran como dibujos animados y palos superpuestos (a, b). Los números que se muestran en los enlaces de van der Waals (líneas discontinuas amarillas) representan distancias (Å) entre los puntos de contacto. Vista de primer plano de la superficie del canal de acceso a la membrana (MAC) de MtFAAH1 unido a NAE18: 2 (c) o p-coumaryl-HL (d).

Simulaciones de dinámica molecular (MDS) de la subunidad A de MtFAAH2a unida a NAE18:2 (a, c) o p-coumaryl-HL (b, d). "0 ns" corresponde a los complejos equilibrados (amarillo), "10 ns" y "100 ns" representan complejos procesados ​​por MDS en 10 (azul) y 100 ns (cian). Vistas más amplias y de primer plano de las regiones de las hélices (residuos 530–536) que se muestran como dibujos animados y barras superpuestas, bolsillo de unión al sustrato (SBP) con ligando (esferas) y residuos superpuestos (barras) elegidos de experimentos de acoplamiento, y hélices α1 y α2 predichas se muestran como dibujos animados y palos superpuestos (a, b). Los números que se muestran en los enlaces de van der Waals (líneas discontinuas amarillas) representan distancias (Å) entre los puntos de contacto. Vista de primer plano de la superficie del canal de acceso a la membrana (MAC) de MtFAAH1 unido a NAE18: 2 (c) o p-coumaryl-HL (d).

En el SBP de MtFAAH1, NAE18: 2 parece requerir acomodación de su cadena de acilo a través de Thr534 y Met531 (Fig. 4a; Tabla complementaria S6, Video complementario S1, S2). Estos residuos están dentro de una región helicoidal (residuos 530 a 536) que se sabe que es necesaria para el mecanismo de "apretar" y "bloquear", como se informó para AtFAAH en otra parte1. A los 10 y 100 ns, se observaron interacciones de van der Waals entre Thr534 y varios carbonos de la cadena de acilo de NAE18:2, a saber, C14 a C16 y C12-C13, respectivamente. Además, el residuo Met531 que se encuentra al final de la región de la hélice parece ser muy flexible y podría formar interacciones similares con NAE18:2 en la posición C10, como se muestra a 100 ns (Fig. 4a). Una inspección minuciosa en el SBP reveló que la conformación de la cola de acilo de NAE18:2 cambió con el tiempo. De hecho, la cola NAE18: 2 fue muy flexible durante la simulación, especialmente de C12 a C18, y se orientó de C1 a C9 en línea recta a 100 ns (Fig. 4a; Video complementario S1, S2). Por lo tanto, sugiere un SBP altamente flexible adecuado para la acomodación de acil amidas con largas cadenas de acilo. Además, el análisis de MAC reveló un movimiento hacia adentro de la hélice α1 (residuos 51–58). Este movimiento parece conducir al cierre del MAC luego de la unión a NAE18:2 (Fig. 4c), lo que puede sugerir un mecanismo de "bloqueo" para confinar el sustrato en el bolsillo de unión para la catálisis (Video complementario S3). Por el contrario, el análisis de MtFAAH1 unido a p-coumaryl-HL sugirió que este aril-HL está mal acomodado en el SBP de MtFAAH1 con pocas interacciones potenciales (Fig. 4b; Video complementario S4, S5). De hecho, la región de la hélice (residuos 530–536) no pareció interactuar en absoluto con el sustrato p-coumaryl-HL. Además, los residuos como Met531 y Thr534 estaban lejos de interactuar con la cola aromática de p-coumaryl-HL (Video complementario S5), lo que sugiere que las interacciones proteína-ligando en esta región del SPB son muy poco probables para p-coumaryl. -HL. Por último, no se observaron cambios drásticos ni en la conformación de la estructura de p-coumaryl-HL ni en el movimiento de la hélice α1 de MtFAAH1 MAC, lo que resultó en un MAC abierto o parcialmente abierto durante el curso de la simulación (Fig. 4b, d; Vídeo complementario S6).

A diferencia del caso con MtFAAH1, la región de la hélice (residuos 532–538) de MtFAAH2a no mostró un movimiento dramático hacia el sustrato NAE18: 2 al unirse (Fig. 5a; Tabla complementaria S6; Video complementario S7, S8). Sin embargo, se encontraron interacciones de van der Waals entre Tyr533 y la cadena de acilo de NAE18: 2 en C13 y C16 (10 ns) y en las posiciones C11 y C12 (100 ns) (Fig. 5a). Ningún otro residuo en esta región parecía estar involucrado o en estrecho contacto con la cadena de acilo de NAE18:2. Además, la conformación de la cadena de acilo de NAE18:2 de C1 a C9 parecía estar muy comprimida y con pocos movimientos en el transcurso de la simulación. Este ligando exhibió múltiples contorsiones en diferentes posiciones de carbono de su cola al final de la simulación (Fig. 5a; Video complementario S7, S8). A diferencia del SBP más abierto de MtFAAH1, NAE18:2 encajaba dentro del SBP más pequeño de MtFAAH2a parecía ser mucho más limitado y restrictivo. Se registró un ligero movimiento hacia afuera de la hélice α1 (residuos 52–59) durante el transcurso de la simulación; sin embargo, este movimiento no coincidió con la apertura o el cierre del MAC de MtFAAH2a MAC (Fig. 5c; Video complementario S9). La unión de MtFAAH2a a p-coumaryl-HL fue respaldada por múltiples interacciones, incluido el residuo Tyr533 (Fig. 5b; Video complementario S10, S11). Durante el tiempo de simulación, hubo interacciones cercanas consistentes entre este residuo de tirosina y la cola aromática de p-coumaryl-HL. Estas probables interacciones π-π podrían estar fijando este ligando en su lugar para la catálisis (Fig. 5b; Video complementario S11). Además, también notamos interacciones hidrofóbicas consistentes entre el anillo HL de la cabeza y el residuo Trp341 ubicado en el canal de acceso citosólico (CAC) del SBP de MtFAAH2a (Fig. 5b; Video complementario S10). Finalmente, aunque se detectaron algunos ligeros desplazamientos hacia afuera en la hélice α1 (residuos 52–59) del MAC de MtFAAH2a (Fig. 5b), no se encontraron cambios sustanciales y el MAC permaneció en una conformación cerrada durante la simulación de 100 ns (Fig. 5d; Vídeo complementario S12).

En conjunto, estos datos sugieren distintos medios para el ajuste de sustratos de aciletanolamida en las SBP de las enzimas MtFAAH1 o MtFAAH2a. Nuestros experimentos de MDS resaltan los residuos potenciales que podrían estar involucrados en la acomodación preferencial de NAE o sustratos de arilo HL por estas dos isoformas enzimáticas.

Para probar las diferencias funcionales entre MtFAAH1 y MtFAAH2, clonamos MtFAAH (Figura complementaria S12; Tabla complementaria S8) en vectores de expresión como fusiones etiquetadas con His para la producción de proteínas recombinantes en E. coli. Para purificar las proteínas recombinantes, utilizamos técnicas de cromatografía de afinidad (IMAC) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de metal inmovilizado (níquel) (Fig. 6). Observamos bandas prominentes en ≈ 70 kDa que representan MtFAAH1 y MtFAAH2a de las muestras purificadas con IMAC y SEC (Fig. 6b, d). Estas bandas eran equivalentes a los pesos moleculares (MW) calculados de las proteínas MtFAAHs. Para evaluar si los estados de oligomerización de cada MtFAAH purificado difieren de los de AtFAAH1, los volúmenes de elución de los cromatogramas de los estándares de filtración en gel y AtFAAH se utilizaron como referencia para los cálculos de MtFAAH (Fig. 6a; Fig. Suplementaria S13). Observamos un volumen de elución promedio de 10,08 ml (a pH 9,0) y 10,14 ml (a pH 7,5) para MtFAAH1 y MtFAAH2a, respectivamente (Figura complementaria S13). En solución, el PM de MtFAAH1 se estimó en ≈ 346 kDa y MtFAAH2a en ≈ 371 kDa (Fig. 6c, e; Fig. S13 complementaria). Teniendo en cuenta los pesos moleculares de las subunidades individuales de MtFAAH1 y MtFAAH2 como 69,6 o 70,1 kDa, respectivamente (Fig. 6; Fig. complementaria S13), y el peso molecular informado de las micelas DDM como ≈ 70 kDa35, estimamos que MtFAAH1 y MtFAAH2a se purificaron cada uno como tetrámeros (Fig. S13 complementaria). Los geles SDS-PAGE sin recortar/sin editar utilizados para la figura 6b, d se pueden encontrar en las figuras complementarias. S19 y S20, respectivamente, mientras que los geles originales utilizados para la Fig. S13 complementaria se pueden encontrar en las Figs. S21–S23.

Purificación de Medicago truncatula FAAH1 y FAAH2a. (a) Cromatograma Superdex 200 Increment 10/300 GL de estándares de filtración en gel: tiroglobulina, 670 kDa; apoferritina, 481 kDa; γ-globulina, 158 kDa; ovoalbúmina, 44 kDa; mioglobina, 17 kDa; vitamina B12, 1,35 kDa. ( b ) Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie de fracciones tomadas durante la purificación de MtFAAH1. Escalera de peso molecular (carril M), lisado celular de células BL21 (DE3) después de la sonicación (carril 1), restos de células sedimentadas después de la sonicación (carril 2), flujo a través de la columna IMAC (carril 3), elución de IMAC (carril 4), proteína purificada por cromatografía de exclusión por tamaño (carril 5). ( c ) Cromatograma Superdex 200 Increment 10/300 GL de purificación MtFAAH1. ( d ) Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie de fracciones tomadas durante la purificación de MtFAAH2a. Escalera de peso molecular (carril M), lisado celular de células BL21 (DE3) después de la sonicación (carril 1), restos de células sedimentadas después de la sonicación (carril 2), flujo a través de la columna de afinidad de níquel (carril 3), proteína purificada por afinidad de níquel (carril 4), proteína purificada por cromatografía de exclusión por tamaño (carril 5). ( e ) Cromatograma Superdex 200 Increment 10/300 GL de purificación de MtFAAH2a. Las flechas y los corchetes apuntan a las fracciones purificadas por SEC que se analizaron mediante SDS-PAGE y se usaron para ensayos de actividad enzimática. Los geles SDS-PAGE sin recortar/sin editar que se muestran en (b) y (d) se pueden encontrar en las Figs. S19 y S20, respectivamente.

Además, utilizamos cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS) para confirmar la identidad de las proteínas recombinantes MtFAAH y AtFAAH purificadas (Figuras complementarias S14, S15, S16). MtFAAH1, MtFAAH2a y AtFAAH tuvieron valores de cobertura del 77 % (43 péptidos únicos), 37 % (17 péptidos únicos) y 100 % (243 péptidos únicos), respectivamente. En conjunto, estos resultados demuestran la producción y purificación de las proteínas MtFAAH1 y MtFAAH2a, y sugieren que ambos complejos de proteína MtFAAH purificados son más grandes que los dímeros AtFAAH1, probablemente organizados como homotetrámeros. Los geles sin recortar/sin editar utilizados para las Figs. S14–S16 se puede encontrar en las figuras complementarias. S24–S26.

Como paso de caracterización inicial, se midieron las actividades enzimáticas de MtFAAH1 o MtFAAH2a hacia NAE12: 0 en diferentes condiciones de pH o temperatura (Fig. S17 complementaria). Las proteínas purificadas con SEC se incubaron con NAE12:0 100 µM en tampones de reacción con diferentes condiciones de pH (6,0, 7,0, 8,0 y 9,0) o temperatura (20, 30, 40 y 50 °C). Se utilizó un ensayo flexible basado en fluorescamina para la detección de productos de reacción, como se informó en otro lugar22,36. La actividad enzimática se calculó como μmol de etanolamina producida por minuto por miligramo de proteína en base a una curva estándar para etanolamina. La actividad de MtFAAH1 fue la más alta a pH 8.0 o 9.0 (Fig. S17 complementaria), mientras que MtFAAH2a operó al máximo a pH 7.0 u 8.0 (Fig. S17 complementaria). En particular, la actividad de MtFAAH2a disminuyó drásticamente a pH 9,0. Las dependencias templadas fueron similares tanto para MtFAAH1 como para MtFAAH2a, con actividades enzimáticas óptimas a temperaturas entre 30 y 40 ° C (Figura complementaria S17). GC-MS confirmó además la conversión de NAE12: 0 en su correspondiente producto de ácido graso libre (FFA) (Fig. S18 complementaria) para las enzimas MtFAAH y el control positivo, AtFAAH; se usaron enzimas hervidas ("desnaturalizadas") como controles negativos y no mostraron conversión de sustrato en producto. La identidad del pico NAE12: 0 se confirmó mediante el tiempo de retención y los iones de diagnóstico (Fig. S18 complementaria) como se informó en otra parte23. La identidad de FFA 12: 0 (ácido dodecanoico) se confirmó mediante iones de diagnóstico (Fig. S18 complementaria) y mediante la comparación de la biblioteca NIST (≈ 98% de coincidencia). En las reacciones con MtFAAH1, MtFAAH2a o AtFAAH hervidos, solo aparecieron en los cromatogramas los picos correspondientes al sustrato NAE12: 0 (Fig. S18 complementaria).

Para evaluar el progreso de la purificación de MtFAAH1 o MtFAAH2a, se midieron las actividades enzimáticas en lisados ​​celulares, fracciones purificadas con IMAC y SEC hacia NAE12:0 (100 µM) (Tabla complementaria S7). Los niveles de purificación y los rendimientos se calcularon en relación con los lisados ​​crudos. Se estimó que MtFAAH1 y MtFAAH2a estaban enriquecidos sobre los extractos celulares en 1162 veces y 3263 veces, respectivamente. La electroforesis en gel SDS confirmó la pureza de cada proteína en las fracciones SEC (Fig. 6; Fig. S13 complementaria).

Dadas las diferencias de residuos clave entre los SBP de MtFAAH1 y MtFAAH2a, y el hecho de que los experimentos de acoplamiento sugieren una acomodación diferencial de los sustratos de N-acilo, planteamos la hipótesis de que tales diferencias podrían dar lugar a distintas preferencias de sustrato para MtFAAH1 y MtFAAH2a. Se incubaron concentraciones crecientes de NAE12:0, NAE18:2, NAE-9-HOD, OdDHL, OtDHL, p-cumaril-HL, p-cumariltiramina y afinina con MtFAAH1 o MtFAAH2a purificado a 30 °C durante 30 min (Fig. 7). Se usaron ensayos basados ​​en fluorescamina para la detección de productos de reacción. La velocidad inicial (V) de las reacciones se presenta como μmol de amina producida por minuto por miligramo de proteína. Las relaciones Kcat/Km derivadas de los gráficos de Michaelis y Menten se usaron para comparar las eficiencias catalíticas de las enzimas para sus sustratos (Fig. 7). MtFAAH1 tuvo las relaciones Kcat/Km más altas para NAE de cadena larga (NAE-9-HOD o NAE18:2) o AHL (OdDHL u OtDHL). Luego, en comparación con OtDHL, las relaciones Kcat/Km disminuyeron en ≈ 2 a tres veces para NAE12:0 o afinina. Los valores de Kcat/Km para p-coumaryl-HL o p-coumaryltyramine fueron los más bajos entre todos los sustratos probados para MtFAAH1 (≈ 7 a 12 veces más bajos en comparación con NAE-9-HOD) (Fig. 7a,c). Por el contrario, MtFAAH2a tenía los valores más altos de Kcat/Km para afinina, p-cumariltiramina o p-cumaril-HL. En comparación con p-coumaryl-HL, la Kcat/Km de MtFAAH2a disminuyó ≈ dos veces para NAE12:0, OdDHL u OtDHL. En particular, MtFAAH2a tenía las relaciones Kcat/Km más bajas para NAE18:2 o NAE-9-HOD (≈ 4 a nueve veces menor que la de afinina) (Fig. 7b, d). Estos datos indican que, en estas condiciones in vitro, MtFAAH1 prefiere sustratos lipófilos con restos acilo más largos, mientras que MtFAAH2a se comporta mejor con sustratos con restos acilo aromáticos o cortos (resumidos en la Fig. 8).

Curvas cinéticas de enzimas para (a) MtFAAH1 y (b) MtFAAH2a. Los MtFAAH se incubaron con concentraciones crecientes de NAE12:0, NAE18:2, NAE-9-HOD, OtDHL, OdDHL, p-coumaryl HL, p-coumaryltyramine o afinina. Las reacciones se realizaron en tampón de reacción (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM) a pH = 9 y 0,03 % de DDM para MtFAAH1 ya pH = 7,5 y 0,06 % de DDM para MtFAAH2a. En el eje X se muestran diferentes concentraciones de sustrato (S) (5–100 µM). En el eje Y, la velocidad de reacción (V) se expresa como μmol de amida producida por unidad de tiempo (min) por cantidad de proteína utilizada (mg). Km (constante de Michaelis y Menten) y V se calcularon en GraphPad Prism 8.0. La relación Kcat (número de rotación)/Km indica la eficiencia aparente de amidohidrolasa de (c) MtFAAH1 o (d) MtFAAH2a hacia un sustrato dado. Los datos representan medias ± DE de ensayos por triplicado.

Modelo simplificado que muestra las eficiencias aparentes de amidohidrolasa de MtFAAH1 o MtFAAH2a frente a N-acilamidas seleccionadas. El modelo propone que las diferencias estructurales y fisicoquímicas entre los bolsillos de unión al sustrato (SBP) de estos dos MtFAAH, específicamente en el canal de acceso citosólico (CAC) y el canal de unión acilo (ABC), están asociadas con la selectividad de FAAH a un sustrato dado. De hecho, los datos computacionales y bioquímicos sugieren un escenario en el que MtFAAH1 prefiere hidrolizar N-acilamidas largas, mientras que MtFAAH2a es mejor para hidrolizar sustratos con una cadena de acilo corta o una cola aromática.

FAAH hidroliza NAE o estructuras similares a NAE en sus correspondientes productos de amina (grupo de cabeza) y ácidos grasos libres (grupo de cola)1,30,37. Recientemente, las comparaciones estructurales y filogenéticas de FAAH de múltiples angiospermas llevaron al descubrimiento de dos grupos de FAAH, FAAH1 y FAAH2, lo que sugiere un perfil de sustrato FAAH-acilamida más complejo de lo que se pensaba anteriormente32. Aquí, dos isoformas FAAH de la leguminosa Medicago truncatula se compararon a nivel estructural (previsto) y funcional por primera vez, revelando hallazgos sorprendentes. Aunque ambas isoformas hidrolizan una variedad de sustratos de acilamida, lo hacen con eficiencias opuestas, lo que sugiere que una consecuencia evolutiva de la elaboración de FAAH en las angiospermas es ampliar la gama de sustratos de acilamida que pueden utilizar estas enzimas. Estas diferencias solo ahora se están revelando al observar las isoformas de FAAH distribuidas fuera de Brassicaceae32, donde solo ocurre una FAAH (FAAH1), y donde se han realizado la mayoría de los estudios moleculares y bioquímicos.

En las comparaciones cinéticas de estos FAAH in vitro, MtFAAH1 parecía utilizar NAE de cadena larga (p. ej., NAE18:2) mejor que los sustratos aromáticos o de cadena más corta. Por el contrario, MtFAAH2a fue mucho menos eficiente en la hidrólisis de NAE de cadena larga y, en cambio, hidrolizó sustratos aromáticos o de cadena corta (p. ej., p-cumaril-HL) con una eficiencia ~ 10 veces mayor. Los experimentos de acoplamiento y simulación dinámica molecular (MDS) con sustratos en los SBP de estos dos FAAH respaldaron estas diferencias en el comportamiento de las enzimas. Se predijo que MtFAAH1 tendría una SBP más abierta y menos restrictiva y un canal de acceso a la membrana (MAC) más flexible que acomodaría mejor las NAE de cadena larga (p. ej., NAE18:2). Por el contrario, el SBP de MtFAAH2a con NAE18: 2 unido tenía una forma diferente y condujo a una orientación más comprimida de la cadena de acilo más larga y una MAC cerrada inalterada. De manera similar, AtFAAH recombinante (un FAAH1) hidrolizó una variedad de NAE y AHL de una manera que dependía de la longitud de la cadena de acilo en lugar del grupo de cabeza polar22. De hecho, se ha demostrado en otro lugar que la actividad de AtFAAH fue la más alta para las AHL de cadena larga (p. ej., OdDHL u OtDHL) y la más baja para las AHL más cortas (p. ej., OHHL u OOHL)22. De manera similar, observamos que MtFAAH1 fue significativamente mejor para hidrolizar OdDHL u OtDHL que los sustratos de acilo aromático o de cadena corta (p. ej., p-cumaril-HL). Por otro lado, las acilamidas de cadena corta o aromáticas se acomodaron bien en la SBP de MtFAAH2a; en los experimentos de acoplamiento y MDS con un aril-HL, tanto la cabeza del anillo de lactona como la cola aromática de p-coumaryl-HL parecían estar mejor acomodados en el SBP de MtFAAH2a que en MtFAAH1, quizás atribuido en parte a la presencia de grandes compuestos aromáticos. residuos en MtFAAH2a (por ejemplo, Tyr533, Tyr444, Trp341). Las alcamidas (p. ej., afinina) son sustratos deficientes para AtFAAH20. Aquí, los datos cinéticos para MtFAAH1 respaldan una conclusión similar en la que MtFAAH1 hidrolizó NAE de cadena larga de manera más eficiente que la afinina. Por el contrario, MtFAAH2a exhibió las eficiencias catalíticas más altas hacia la afinina en comparación con las NAE, y es probable que la mayor cantidad de residuos no polares en el canal de acceso citosólico de MtFAAH2a ayudara a respaldar la interacción con las alcamidas. En conjunto, parece que las diferencias estructurales entre los SBP de MtFAAH1 y MtFAAH2a y sus interacciones predichas con los sustratos fueron consistentes en general con las diferencias observadas en las eficiencias hidrolíticas (Fig. 6). En particular, la molécula de detección de quórum p-coumaryl-HL38 fue un sustrato eficiente para MtFAAH2a. Es tentador especular que M. truncatula ha desarrollado una maquinaria FAAH2 que expande el rango de "comunicación" química de las plantas para las interacciones microbianas. Aunque las implicaciones biológicas de la hidrólisis de p-coumaryl-HL por MtFAAH2a están más allá del alcance de este estudio, nuestros resultados brindan ideas interesantes para probar las funciones potenciales de MtFAAH2a en la planta.

La divergencia observada en las preferencias de sustrato entre las dos isoformas FAAH de Medicago recuerda un poco el concepto en los mamíferos placentarios donde están presentes dos isoformas FAAH divergentes. En humanos, las tasas hidrolíticas de dos FAAH diferentes (≈ 20% de identidad) mostraron algunas preferencias distintas y superpuestas hacia diferentes sustratos39. En ese estudio, un FAAH1 fue mucho más eficaz para hidrolizar sustratos poliinsaturados (p. ej., NAE20:4), mientras que FAAH2 prefirió las acilamidas monoinsaturadas (p. ej., oleamida). En el mismo informe; FAAH1 fue capaz de procesar la acilamida conjugada con aminoácidos, N-oleoil-taurina (NAT), mientras que FAAH2 fue incapaz de utilizar este sustrato. Curiosamente, ambos FAAH hidrolizaron NAE18:139 de manera similar. Al menos para FAAH1 de mamíferos, se informa que la unión del sustrato en el sitio activo está influenciada por dos residuos de aminoácidos aromáticos que forman una "paleta dinámica" y esto puede contribuir a la selectividad del sustrato1,6. Un tercer tipo de amida hidrolasa en mamíferos tiene una preferencia de sustrato muy estricta. En conejo (Oryctolagus cuniculus), se demostró que una cisteína hidrolasa, denominada N-aciletanolamina amidasa ácida (NAAA), tiene una marcada preferencia por NAE16:0, y esto parece depender de la naturaleza de su SBP. De hecho, parece que a través de la evolución, NAAA adquirió una SBP de forma restrictiva que es óptima para NAE16:0 y menos eficiente con otras acilamidas de cadena de acilo más larga o más corta40. Por lo tanto, al igual que los mamíferos, la leguminosa M. truncatula puede haber elaborado isoformas FAAH que procesan selectivamente una variedad de sustratos de acilamida.

Las propiedades bioquímicas de lo que ahora se considera FAAH del grupo 1 se han caracterizado previamente a partir de Arabidopsis1,41, arroz42, Medicago truncatula42 y un musgo (P. patens)9, aunque no todos los estudios se llevaron a cabo con enzimas purificadas, y no todas las FAAH1 los homólogos se probaron con una amplia gama de sustratos de acilamida. Aquí se describen por primera vez las propiedades bioquímicas de una enzima FAAH del grupo 2 y se observaron algunas similitudes y diferencias con las isoformas FAAH del grupo 1 en el progreso de la purificación y en los ensayos de actividad enzimática. Además de las diferencias en las preferencias de sustrato aparentes como se describe anteriormente, otras características de las enzimas eran diferentes. El punto isoeléctrico de MtFAAH2a es significativamente más alto que el de MtFAAH1 (u otras proteínas FAAH1) que requirieron condiciones alteradas para la solubilidad durante el curso de la purificación (y probablemente también influyeron en el pH óptimo para los ensayos in vitro). La consideración del pH del tampón en relación con el punto isoeléctrico de la proteína es importante para la purificación de proteínas recombinantes, como se informó en otro lugar43. Además, MtFAAH2 requirió el doble de concentración de DDM en comparación con MtFAAH1 para mantener la solubilización durante el progreso de la purificación. A pesar de estas diferencias, tanto MtFAAH1 como MtFAAH2a se purificaron hasta casi la homogeneidad y, en función de su migración en relación con estándares conocidos, parecían resolverse como tetrámeros homoméricos en SEC. En general, los factores identificados aquí facilitarán los estudios futuros de las enzimas FAAH en otras especies de plantas.

Nuestros datos respaldaron consistentemente la idea de que tanto MtFAAH1 como MtFAAH2a se pueden encontrar como oligómeros tetraméricos cuando se purifican en solución con detergente, mientras que AtFAAH se solubiliza como un dímero. Informes anteriores respaldan estados oligoméricos para FAAH de múltiples organismos. Por ejemplo, la estructura cristalina de FAAH de Arabidopsis o del hongo Candida albicans indicó dímeros1,44. En particular, Rat FAAH también se informa como un dímero cuando se purifica en solución, pero puede formar tres octámeros de dímeros en ausencia de detergente45. Las diferencias de tamaño evidentes de las apoenzimas purificadas aquí de Medicago truncatula (diferentes de la única otra planta FAAH, AtFAAH, para la que existe una estructura) es intrigante y puede tener implicaciones funcionales importantes, pero la estructura cuaternaria y su relevancia funcional deben esperar en el futuro. estudios. Además, queda por ver si esta organización tetramérica predicha es una característica de las isoformas FAAH de otras especies de plantas fuera de Brassicaceae.

En conclusión, los MtFAAH hidrolizan diferencialmente una amplia gama de NAE, acil-HL, aril-HL, alcamidas o amidas fenólicas. Dichos resultados coinciden con las diferencias entre la organización estructural predicha de los SBP de MtFAAH1 y MtFAAH2a. Aunque en nuestras investigaciones analizamos las capacidades in vitro de los MtFAAH frente a sustratos que se informó que se acumulan endógenamente en tejidos vegetales (p. ej., NAE) o en bacterias (p. ej., AHL), es posible que aún no se hayan descubierto sustratos lipófilos adicionales con relevancia fisiológica. . Más estudios a nivel genético y fisiológico ayudarán a desentrañar la función de isoformas FAAH adicionales en Medicago truncatula. Además, se requerirá un examen adicional de las isoformas de FAAH en otras especies de plantas para determinar la importancia más amplia de la hidrólisis de acil amida mediada por FAAH en las plantas. Sin embargo, este estudio proporciona una base para el trabajo futuro para descubrir el significado fisiológico potencial y las posibles aplicaciones biotecnológicas.

Las secuencias de leguminosas utilizadas para la Fig. 1a se recuperaron de la base de datos NCBI (Tabla complementaria S1). El análisis filogenético se llevó a cabo con la herramienta en línea "Phylogeny.fr" con la configuración predeterminada46. La alineación de la secuencia se realizó en Clustal Omega47 (Figuras complementarias S1, S7). Los modelos de homología MtFAAH1 y MtFAAH2a se construyeron con Arabidopsis FAAH como plantilla (AtFAAH; 6DHV) en SWISS-MODEL48. Los modelos 3D se visualizaron en Pymol49 y BIOVIA Discovery Studio Visualizer50. Los residuos que comprenden la tapa de unión a la membrana (MBC), el canal de acceso a la membrana (MAC), la región helicoidal (que se prevé que esté involucrada en la acomodación de la cola de acilamida) y las estructuras de bolsillo de unión al sustrato (SBP) para MtFAAH se predijeron a partir de los detalles en la estructura AtFAAH1 ( Figs. 4, 5; Tabla complementaria S5, S6). Se usó Antheprot3D para la predicción del contenido de la estructura secundaria 51 (Fig. S5 complementaria). Los parámetros de calidad para los modelos MtFAAH generados en SWISS-MODEL incluyen; Puntuaciones GMQE (estimación de calidad del modelo global), QMEANDisCo (restricción de distancia basada en el consenso de Qmean) y gráficas y puntuaciones de Ramachandran (Figuras complementarias S3, S4; Tabla complementaria S3, S4).

Los perfiles de expresión de MtFAAH1, MtFAAH2a y MtFAAH2b se recuperaron del Atlas de expresión génica de Medicago truncatula "MtExpress"34. Las secuencias de MtFAAH correspondientes (consulte la Tabla complementaria S1 para los números de acceso) se usaron como entrada en la herramienta BLAST construida dentro del Atlas.

Las topologías de las formas apo de MtFAAH1 y MtFAAH2a se realizaron con el campo de fuerza Amber (ff19SB)52. Se construyó una caja cúbica de 12 Å alrededor de las isoformas de apo MtFAAH y los sistemas se solvataron en agua TIP3P53. La neutralización de las cargas se realizó mediante iones Na+ y Cl- a una concentración de 0,15 M. El sistema se sometió a minimización de energía con una temperatura de 298 K y una presión de un bar. Luego, los sistemas se equilibraron con una constante de fuerza de 500 kJ/mol durante 5 ns. Las simulaciones dinámicas moleculares (MDS) se llevaron a cabo en el entorno de simulaciones moleculares basado en la nube desarrollado en otros lugares54. Esta tubería utiliza el kit de herramientas Open MM55 para generar conjuntos de temperatura constante, presión constante (NPT). El ambiente MD tenía una temperatura de 298 K y una presión de un bar. Las unidades GPU y de computadora en Google Collab se usaron para ejecutar simulaciones de 100 ns para ambos MtFAAH. Cada simulación tomó de 12 a 13 h para llegar a su finalización. Las trayectorias RMSD y RMSF se generaron con los kits de herramientas MDAnalysis56 o PyTraj57 y luego se procesaron en Excel 2021 (Figura complementaria S8).

Todas las estructuras 2D se dibujaron utilizando el software ChemDraw (Molecular Editor). Los sustratos y las enzimas se prepararon como sigue; los archivos SDF de NAE18:2 (CID: 5,283,446), NAE12:0 (CID: 8899) o p-coumaryl-HL (CID: 71,311,837) se recuperaron de PubChem. Luego, se utilizó Babel 3.0.158 para convertir los archivos SDF a formato PDB. Los archivos PDB de las estructuras apo MtFAAH generadas después de MDS de 100 ns (ver arriba) se usaron para experimentos de acoplamiento antes de la eliminación de agua, Na+ y iones Cl-. Se agregaron hidrógenos a sustratos y modelos de proteínas MtFAAH1 o MtFAAH2a en Pymol49. La minimización de energía se realizó en PyRx59 con la configuración predeterminada.

El acoplamiento en el software GOLD 3.0.160 se centró en el enlace covalente entre los oxígenos de la cadena lateral (Oγ) de los residuos catalíticos de MtFAAH1 (Ser304; número de átomo 4628) o MtFAAH2a (Ser311; número de átomo 4678) y el carbono del carbonilo de NAE18:2, NAE12:0 o p-cumaril-HL. La detección de cavidades se estableció con un radio de 20 Å alrededor del sitio activo. Se utilizaron constantes de resorte entre 50 y 500, y separaciones mínimas (1,30 Å) y máximas (1,60 Å) en los ajustes de restricción. Los parámetros de recocido para van der Waals y enlaces de hidrógeno se establecieron en 6 y 3 Å, respectivamente. El algoritmo se fijó con valores de energía externa e interna de 1,4 y 1,0, respectivamente. Las poses pronosticadas se clasificaron en función de la puntuación GOLD de fitness. La pose con la puntuación más alta fue elegida para su posterior análisis. Todas las poses elegidas en este estudio tenían puntajes GOLD superiores a 10. Las predicciones de acoplamiento se visualizaron en Pymol49 y BIOVIA Discovery Studio Visualizer50. Las interacciones putativas, como los enlaces de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas, se predijeron en el servidor del perfilador de interacción proteína-ligando (PLIP)61.

Las topologías de proteínas (MtFAAH1 o MtFAAH2a) y ligandos (NAE18:2 o p-coumaryl-HL) se generaron con los campos de fuerza ámbar ff19SB55 y GAFF262, respectivamente. Se construyó una caja cúbica de 15 Å alrededor de los complejos proteína-ligando, luego los sistemas se solvataron en agua TIP3P53. La neutralización de las cargas se realizó mediante iones Na+ y Cl- a una concentración de 0,15 M. El sistema se sometió a minimización de energía con una temperatura de 298 K y una presión de un bar. Los sistemas se equilibraron con una constante de fuerza de 1600 kJ/mol durante 5 ns. Los experimentos de MDS se llevaron a cabo en la canalización de simulaciones moleculares basadas en la nube desarrollada en otros lugares54. La misma temperatura y presión usadas para el equilibrio se usaron para la producción de MD. Las unidades GPU y de computadora en Google Collab se usaron para ejecutar simulaciones de 100 ns para todos los complejos de ligandos MtFAAH. Cada simulación tardó de 12 a 13 h en completarse. Las trayectorias y los archivos de registro se registraron cada 100 ps. Además, para imitar la interacción del enlace covalente entre los oxígenos de la cadena lateral (Oγ) de los residuos catalíticos de los MtFAAH y el carbono del grupo carbonilo de los ligandos, agregamos una restricción armónica entre esos átomos bajo la herramienta MonteCarloBarostat en desarrollo". Haz que llueva"54. Las trayectorias RMSD y RMSF se generaron con los kits de herramientas MDAnalysis56 o PyTraj57 y luego se procesaron en Excel 2021 (Figura complementaria S10). El análisis de correlación cruzada de Pearson se generó dentro de la misma canalización54 (Figura complementaria S11). Los complejos equilibrados (tiempo = 0 ns) y los complejos procesados ​​por MD a 10 ns y 100 ns se procesaron en Pymol49 eliminando agua y iones Na+ y Cl- de sus estructuras (Figs. 4 y 5). Los archivos PDB y las trayectorias dcd de los complejos MtFAAH-ligando se cargaron en el software VMD63 para el análisis de la simulación MD. VideoMach64 se combinó con VMD para generar los videos correspondientes a los experimentos de MDS (videos complementarios S1–S12).

Qiagen RNeasy Plant Mini Kit se utilizó para la extracción de ARN de tallos de plántulas de Medicago truncatula Gaertner (genotipo de tipo salvaje Jemalong A17) de 21 días de edad. Las semillas de M. truncatula (A17) fueron un regalo de la Dra. Rebecca Dickstein de la Universidad del Norte de Texas (UNT), como se informó y utilizó en otros lugares65. Las plántulas utilizadas para la extracción de ARN se cultivaron en cámaras iluminadas y su uso cumplió con las normas internacionales, nacionales y/o institucionales. La síntesis de cDNA se llevó a cabo con el kit Thermo Fisher High Capacity cDNA Reverse Transcription de Applied Biosystems, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se necesitaron dos rondas de PCR (PCR anidada) para producir la secuencia de codificación de longitud completa (CDS) de MtFAAH1 (Fig. S12 complementaria). El codón de terminación de MtFAAH1 se eliminó de su CDS con cebadores específicos (Tabla complementaria S8). Se usó ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs) para PCR de alta fidelidad. Se usó la escalera de ADN MassRuler de 1 Kb (Thermo Fisher) para estimar el tamaño del producto de PCR. La inserción de MtFAAH1 CDS en el plásmido pTrcHIS2 (Invitrogen) se logró mediante clonación TA, siguiendo las instrucciones del fabricante.

El CDS de MtFAAH2a fue sintetizado por GENEWIZ e insertado en el vector pUC57-Amp. Luego, se usaron cebadores específicos (Tabla complementaria S8) para eliminar el codón de parada y la subclonación en el plásmido pTrcHIS2 (Invitrogen) (Figura complementaria S12), como se describe anteriormente. Todos los vectores se confirmaron como correctos mediante secuenciación de ADN antes de la expresión heteróloga.

Se produjo MtFAAH1 recombinante en células E. coli BL21 (DE3) a partir del plásmido pTrcHIS2 (Invitrogen) con etiquetas C-terminal c-myc e histidina (6X). Los cultivos durante la noche se cultivaron con 100 µg/mL de ampicilina (GoldBio) a 37 °C y se inocularon en LB fresco que contenía 100 µg/mL de ampicilina y se cultivaron a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó 0,5–1,0. La producción de proteínas se indujo con β-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM (GoldBio) durante 18 ha 16 °C. Las células se recogieron por centrifugación a 4000 Xg durante 30 min a 4 °C y luego se congelaron a -80 °C durante la noche. Después de descongelar en tampón de lisis (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 % (v/v) Triton X-100), 1 mM EDTA, 1 µM E-64, 1 µM pepstatina, 1 mg/ml de lisozima (Sigma ) y se añadieron 25 unidades/mL de Benzonase nuclease (Sigma). El sedimento celular se suspendió mediante rotación a 30 RPM durante 30 min a 4 °C, luego se sonicó (procesador ultrasónico GEX 130) durante 8 min al 20 % de intensidad con 30 s de pulsos y 30 s de pulsos. Los restos celulares se sedimentaron a 14 000 Xg durante 30 min a 4 °C y el lisado se incubó con resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) y se suspendió mediante rotación a 30 RPM durante 1 h a 4 °C. Una vez que el lisado celular se separó por completo de la resina mediante una columna de flujo por gravedad, la resina se lavó con dos tampones: (1) Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, Triton X-100 al 1 %, imidazol 10 mM; (2) Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, dodecil beta-D-maltósido (DDM) al 0,03 % (p/v), imidazol 25 mM. A continuación, la proteína recombinante etiquetada con His se eluyó de la resina con Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, DDM al 0,03 %, imidazol 250 mM, EDTA 1 mM, E-64 1 µM, pepstatina 1 µM. Se añadió DTT (1 mM) fresco a la fracción eluida y se almacenó a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, la fracción eluida se concentró y se cambió a bis-tris-propano 50 mM pH 9,0, NaCl 100 mM, DDM al 0,03 % utilizando un dispositivo de filtro centrífugo de 30.000 MWCO (Sartorius). La proteína recombinante se purificó y fraccionó adicionalmente usando una columna Superdex 200 con aumento de 10/300 GL (Cytiva) en un sistema AKTA Pure (Cytiva). Las fracciones eluidas con SEC se observaron a una absorbancia UV de 280 nm, se fraccionaron y recolectaron para análisis SDS-PAGE, LC/MS/MS o ensayos de actividad enzimática.

El MtFAAH2a recombinante se purificó con los mismos métodos que el MtFAAH1 (ver arriba) excepto por el pH del tampón y la concentración de detergente. Para MtFAAH2a, todos los tampones tenían un pH de 7,5 y un 0,06 % de DDM durante el proceso de purificación. Las fracciones SEC se recogieron para análisis SDS-PAGE, LC/MS/MS y ensayos de actividad enzimática.

Las bandas de gel se deshidrataron con acetonitrilo al 100 % y se incubaron con ditiotreitol 10 mM en bicarbonato de amonio 100 mM, pH ≈ 8, a 56 °C durante 45 min, se deshidrataron nuevamente y se incubaron en la oscuridad con yodoacetamida 50 mM en bicarbonato de amonio 100 mM durante 20 mín. A continuación, las bandas de gel se lavaron con bicarbonato de amonio 100 mM y se deshidrataron de nuevo. Se prepararon tripsina, quimotripsina y Asp-N modificadas de grado de secuenciación a 0,01 µg/µL en bicarbonato de amonio 50 mM y se añadieron ≈ 50 µL de esto a cada banda de gel para que el gel quedara completamente sumergido. A continuación, las bandas se incubaron a 37 °C durante la noche. Los péptidos se extrajeron del gel mediante sonicación en baño de agua en una solución de acetonitrilo al 60 %/TCA al 1 % y se secaron al vacío hasta ≈ 2 µl.

Después, los péptidos se resuspendieron en acetonitrilo al 2 %/TFA al 0,1 % hasta 20 µl. A partir de esto, EASYnLC 1000 inyectó automáticamente 5 µL en una trampa de péptidos C18 Thermo Acclaim PepMap de 0,1 mm × 20 mm y se lavó durante ≈ 5 min. Luego, los péptidos unidos se eluyeron en una columna C18 Thermo Acclaim PepMap RSLC de 0,075 mm × 250 mm durante 35 min con un gradiente de 5 % B a 38 % B en 24 min, ascendiendo hasta 90 % B a los 25 min y manteniéndose en 90 % B durante la ejecución a un caudal constante de 0,3 µl/min (tampón A = 99,9 % agua/0,1 % ácido fórmico, tampón B = 99,9 % acetonitrilo/0,1 % ácido fórmico). La columna se mantuvo a 50 °C utilizando un calentador de columna integrado (PRSO-V1, Sonation GmbH, Biberach, Alemania).

Los péptidos eluidos se pulverizaron en un espectrómetro de masas ThermoFisher Q-Exactive utilizando una fuente de iones de pulverización Flex Spray. Los escaneos de la encuesta se tomaron en el Orbitrap (resolución de 70 000, determinada a m/z 200) y los 15 iones principales en cada escaneo de la encuesta se sometieron luego a una disociación inducida por colisión (HCD) automática de mayor energía con espectros de fragmentos adquiridos a una resolución de 17 500. Los espectros MS/MS resultantes se convirtieron en listas de picos utilizando Mascot Distiller, v2.8.0.1 (www.matrixscience.com) y se buscaron en una base de datos que incluía secuencias de proteínas FAAH y secuencias de proteínas E.coli disponibles en Uniprot (www. uniprot.org) con contaminantes de laboratorio comunes (descargados de www.thegpm.org, proyecto cRAP) usando el algoritmo de búsqueda Mascot, v 2.7.1. Luego, la salida de Mascot se analizó utilizando Scaffold, v5.0.1 (www.proteomesoftware.com) para validar probabilísticamente las identificaciones de proteínas. Las asignaciones validadas con el filtro de confianza Scaffold 1% FDR se consideran verdaderas. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en ProteomeXchange Consortium66 a través del repositorio de socios PRIDE67,68 con el identificador de conjunto de datos PXD038494 y https://doi.org/10.6019/PXD038494.

Las curvas estándar se formaron trazando el coeficiente de distribución (Kav) frente al logaritmo de los pesos moleculares de estándares conocidos (tiroglobulina, γ-globulina, ovoalbúmina, mioglobina y vitamina B12, Bio-Rad; apoferritina, Sigma) de acuerdo con el Manual Cytiva SEC. , Apéndice 6. Se prepararon dos estándares y curvas estándar separados en relación con las diferentes condiciones utilizadas para purificar los MtFAAH. Luego, se calculó el Kav de cada FAAH utilizando el volumen de elución promedio del pico de seis purificaciones realizadas en días diferentes. Después de interpolar este valor en la curva respectiva, calculamos el peso molecular y estimamos los estados de oligomerización después de tener en cuenta el número de agregación del detergente35. Los cálculos se realizaron en GraphPad Prism 8.0.

Las muestras tomadas durante el progreso de la purificación se cuantificaron mediante el ensayo BCA Rapid Gold (Thermo) y se separaron en un gel de resolución al 10 % preparado mediante SDS-PAGE (Bio-Rad). Se sometieron a SDS-PAGE diez microgramos del lisado celular, restos celulares sedimentados y flujo continuo junto con 2 µg de la proteína purificada por afinidad con níquel y 2 µg de la proteína purificada por SEC. Las muestras se desnaturalizaron en tampón Laemmili 4x (Bio-Rad) con β-mercaptoetanol al 10 % (v/v) y se realizó una electroforesis a 175 voltios constantes durante 50 min. Luego, los geles se tiñeron con tinción azul de Coomassie coloidal QC (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Fig. 6b, d; Figs. complementarias S14–S16, S19, S20, S24–26). Alternativamente, se usaron geles sin manchas BIO-RAD en los experimentos (Figuras complementarias S13, S21–S23). Los pesos moleculares (MW) y los puntos isoeléctricos (pI) de las secuencias de aminoácidos se calcularon con la herramienta en línea ExPasy (https://web.expasy.org/protparam). Sin los codones de terminación, MtFAAH1 tenía un PM de 66,02 kDa y un pI de 5,83 mientras que MtFAAH2a tenía un PM de 66,71 kDa y un pI de 8,48. Las bandas de gel se analizaron y compararon con estándares conocidos (Precision Plus Protein Standards, Bio-Rad) en referencia a los pesos moleculares calculados de los FAAH. Los geles SDS-PAGE sin recortar/sin editar utilizados para la figura 6b, d se pueden encontrar en las figuras complementarias. S19 y S20, respectivamente. Los geles SDS-PAGE sin recortar/sin editar utilizados para la Fig. S13 complementaria se pueden encontrar en las Figs. S21–S23 mientras que los geles originales utilizados para las Figs. S14–S16 se puede encontrar en las figuras complementarias. S24–S26.

Los ensayos de actividad enzimática basados ​​en GCMS se realizaron como se describe en otra parte12 para confirmar los sustratos y los productos de reacción, con algunas modificaciones. Brevemente, el tampón de reacción 1 (50 mM Bis-Tris propano; pH = 9,0; 0,03 % DDM) o el tampón de reacción 2 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl; pH = 7,5; 0,06 % DDM) se mezclaron con 100 µM ( concentración final diluida de solución madre 10 mM en DMSO) de NAE12:0. Luego, se agregaron 5 μg de MtFAAH1 o MtFAAH2a recombinante a las mezclas de reacción 1 o 2, respectivamente. Las reacciones con 1 μg de AtFAAH en la mezcla de reacción 1 se incluyeron como control positivo. La mezcla de reacción se incubó a 30 °C con agitación (120 RPM) durante 1 h. Se incluyeron como controles negativos reacciones paralelas con enzima hervida (15–30 min a 80–100 °C). Las reacciones se detuvieron agregando isopropanol precalentado (IPA), seguido de incubación a 70 °C durante 30 min. A continuación, se llevó a cabo un método de extracción basado en cloroformo para aislar los lípidos generados a partir de las reacciones. Los productos lipídicos se secaron en N2 y se resuspendieron en 50 µl de BSTFA para la derivatización (30 min a 50 °C). Luego, las muestras se secaron bajo N2 y se resuspendieron en 70 µL de hexano. Las muestras fueron analizadas por GCMS (modelo Agilent 7693) bajo las siguientes condiciones; pulsado-split-less (modo de inyección) con una presión interna y un flujo de purga de 48 (kPa) y 50 (mL/min), respectivamente. El helio fue la fase del operador móvil. La fase estacionaria fue una columna capilar (columna GC Agilent HP-5 ms) con una longitud de 30 mm, un diámetro interno de 0,25 mm y un espesor de película de 0,25 μM. El GCMS se ajustó para el módulo MS de impacto de electrones (EI) y los datos espectrales de masa se recopilaron en modo de exploración completa. Los productos de reacción se identificaron como derivados de trimetilsililo (TMS). Finalmente, la identificación y cuantificación de las especies de lípidos de las reacciones se realizaron mediante el análisis de sus tiempos de retención máximos, espectros de masas correspondientes, especies de diagnóstico de iones TMS y/o búsqueda en la biblioteca del NIST (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología).

Los ensayos de actividad enzimática basados ​​en fluorescamina se realizaron tal como se desarrollaron y describieron en otros lugares22,36, con pocas modificaciones. Para los ensayos de actividad enzimática en diferentes condiciones de pH, se incubaron MtFAAH1 o MtFAAH2a recombinantes (1 μg) con 100 μM de NAE12:0 en tampón de reacción 1 (100 mM K-fosfato, 6 mM de K2-fosfato; pH = 6), tampón de reacción 2 (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM; pH = 7), tampón de reacción 3 (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM; pH = 8) o tampón de reacción 4 (Tris-HCl 25 mM, MgCl2 10 mM; pH = 9) en una placa multinivel de 96 pocillos durante 5–10 min a 30 °C. Se añadió DDM (0,03 % o 0,06 %) en cada reacción con MtFAAH1 o MtFAAH2a, respectivamente. Se agregaron sustratos de las soluciones madre a las concentraciones finales deseadas para iniciar las reacciones. Se incluyeron como controles negativos reacciones paralelas con enzima hervida (30 min a 80–100 °C). Se llevaron a cabo tres reacciones independientes (réplicas) en los experimentos. Las reacciones se detuvieron añadiendo 20 µl de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (solución madre 10 mM en DMSO). Se mezcló una alícuota de 15 μL con 45 μL de fluorescamina (stock 3,6 mM en acetona) y 97,5 μL de miliq de agua en una microplaca de 96 pocillos para ensayos basados ​​en fluorescencia. Las mezclas de reacción se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. La fluorescencia se midió en un lector de microplacas multimodo BioTek Synergy 2 ajustado a 390 nm (excitación) y 475 nm (emisión). Los valores de fluorescencia sin procesar de las reacciones se restaron de las lecturas del control negativo. Luego, para transformar los valores fluorescentes en µmol de etanolamina producida, se construyeron curvas estándar por separado con concentraciones variables de etanolamina (Sigma-Aldrich) reaccionadas con fluorescamina. También se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática en cinco condiciones de temperatura diferentes (20, 30, 40, 50 u 80 °C) como se describe anteriormente.

Para la tabla de purificación (Tabla complementaria S7), se usaron fracciones purificadas de lisado celular, IMAC o SEC como fuentes de enzimas para las pruebas de actividad enzimática contra NAE12:0, siguiendo la estrategia indicada anteriormente. La actividad total se representa como una unidad enzimática (U), y esto representa el μmol de producto (etanolamina) generado por unidad de tiempo (min). La actividad específica se calculó dividiendo la actividad total por la cantidad (mg) de proteína utilizada en los ensayos. El rendimiento se representa como valores porcentuales y representa la actividad enzimática que se retiene después de cada paso de purificación. El rendimiento de las fracciones IMAC o SEC se calculó dividiendo la actividad total de cada uno de esos pasos por la actividad total derivada del lisado celular crudo. El nivel de purificación se calculó como una relación entre la actividad específica de las fracciones IMAC o SEC y la actividad específica calculada para el lisado celular crudo. El promedio de reacciones independientes por triplicado se presenta en la Tabla complementaria S7.

Para los ensayos cinéticos enzimáticos, se incubaron MtFAAH1 o MtFAAH2a recombinantes (1 μg) con concentraciones crecientes de NAE o sustratos similares a NAE (5–100 μM) en tampón de reacción (HEPES 25 mM, NaCl 100 mM) a pH = 9 y 0,03 % DDM para MtFAAH1 ya pH = 7,5 y 0,06% DDM para MtFAAH2a. La mezcla de reacción se incubó durante 5 a 10 min a 30 °C. Se incluyeron como controles negativos reacciones paralelas con enzima hervida (30 min a 100 °C). En los experimentos se llevaron a cabo tres reacciones independientes (réplicas técnicas). Sustratos incluidos; NAE12:0 (sintetizado internamente), NAE18:2 (Cayman Chemical), NAE-9-HOD (sintetizado internamente, como se informó en otro lugar23), OdDHL (Sigma-Aldrich), OtDHL (Sigma-Aldrich), p-coumaryl- HL (Sigma-Aldrich), p-cumariltiramina (obsequio del Dr. David Mackey) y afinina (obsequio del Dr. Jorge Molina Torres). Las reacciones se detuvieron añadiendo 20 µl de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (10 mM en DMSO). Se mezcló una alícuota de la reacción con fluorescamina y agua como se describe anteriormente. La mezcla se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. La fluorescencia se midió como se describe anteriormente.

Para transformar los valores fluorescentes en µmol de amina producida, se construyeron curvas estándar con concentraciones crecientes de etanolamina (Sigma-Aldrich) (para NAE), homoserina lactona (Sigma-Aldrich) (para AHL y p-coumaryl-HL), tiramina (Sigma -Aldrich) (para p-cumariltiramina) o isobutilamina (para afinina) (Sigma-Aldrich). Los parámetros cinéticos enzimáticos aparentes se calcularon en GraphPad Prism 8.0. Las curvas ajustadas tenían valores de R2 de 0,54 a 0,94 para MtFAAH1 y de 0,78 a 0,94 para MtFAAH2a.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas generados y analizados durante el estudio actual están disponibles a través de ProteomeXchange con el identificador PXD038494.

Se revisó la versión original en línea de este Artículo: El orden del Video complementario 2 adjunto, Video complementario 3, Video complementario 4, Video complementario 5, Video complementario 6, Video complementario 7, Video complementario 8, Video complementario 9, Video complementario 10 , el video complementario 11 y el video complementario 12 se indicaron incorrectamente como video complementario 10, video complementario 11, video complementario 12, video complementario 2, video complementario 3, video complementario 4, video complementario 5, video complementario 6, video complementario 7, video complementario 8 y el video complementario 9. El video complementario 1 era correcto desde el momento de la publicación.

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Descargar referencias

Agradecemos al Dr. Xiaoqiang Wang (BioDiscovery Institute, University of North Texas) por proporcionar acceso al software GOLD 3.0.1 que se utilizó para los experimentos de acoplamiento molecular. Agradecemos al Dr. David Mackey (Departamento de Horticultura y Ciencias de Cultivos, Universidad Estatal de Ohio) por proporcionar la p-cumariltiramina que se usó en los experimentos. Agradecemos al Dr. Jorge Molina Torres (CINVESTAV-IPN, Irapuato, México) por proporcionar la afinina que se utilizó en los experimentos. Agradecemos a Douglas Whitten (Centro de Apoyo a la Tecnología de Investigación, Universidad Estatal de Michigan) por su ayuda con la identificación de proteínas recombinantes en LC/MS/MS. Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU. (IOS 2051636).

Instituto BioDiscovery, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad del Norte de Texas, Denton, TX, EE. UU.

Omar Arias-Gaguancela, Emily Herrell, Mina Aziz y Kent D. Chapman

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Investigación diseñada por OAG, EH, MA y KDC. MA estableció las condiciones iniciales para la purificación de proteínas y brindó asesoramiento sobre los ensayos de actividad enzimática. OAG y EH realizaron los experimentos. OAG, EH y KDC analizaron los datos. OAG y EH escribieron el primer borrador del manuscrito. KDC editó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Kent D. Chapman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Arias-Gaguancela, O., Herrell, E., Aziz, M. et al. Dos isoformas de amida hidrolasa de ácidos grasos de leguminosas con distintas preferencias por las acilamidas microbianas y de origen vegetal. Informe científico 13, 7486 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34754-z

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Recibido: 22 noviembre 2022

Aceptado: 06 mayo 2023

Publicado: 09 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34754-z

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