Editores de base de citosina mejorados generados a partir de variantes de TadA

Nature Biotechnology volumen 41, páginas 686–697 (2023) Citar este artículo

12k Accesos

4 citas

50 Altmetric

Detalles de métricas

Los editores de base de citosina (CBE) permiten mutaciones de transición genómicas programables de C·G-a-T·A y, por lo general, comprenden una enzima CRISPR-Cas modificada, una citidina desaminasa natural y un inhibidor de la reparación del uracilo. Estudios previos han demostrado que los CBE que utilizan citidina desaminasas naturales pueden causar desaminación de citosina en todo el genoma sin guía. Si bien posteriormente se informaron CBE mejorados que disminuyen los objetivos fuera de los objetivos estocásticos en todo el genoma, estos editores pueden sufrir un rendimiento subóptimo en el objetivo. Aquí, informamos la generación y caracterización de CBE que utilizan variantes diseñadas de TadA (CBE-T) que permiten un alto C·G a T·A en el objetivo a través de un conjunto de secuencias diversas de loci genómicos, demostrando una actividad robusta en células primarias y no causan una elevación detectable en la mutación de todo el genoma. Además, informamos editores de base de citosina y adenina (CABE) que catalizan la edición A-to-I y C-to-U (CABE-T). Junto con los ABE, los CBE-T y los CABE-T permiten la instalación programable de todas las mutaciones de transición utilizando variantes de TadA evolucionadas en laboratorio con propiedades mejoradas en relación con los CBE informados anteriormente.

Los editores de base de citosina (CBE) son enzimas de edición de genes capaces de introducir de forma programable cambios de pares de bases C·G-to-T·A en el ADN genómico de las células vivas. Esta conversión química se logra a través de la desaminación hidrolítica mediada por enzimas de la citosina a uracilo, que las ADN polimerasas1 interpretan como timina. Hasta la fecha, los CBE generalmente se componen de cuatro componentes distintos: una citidina desaminasa natural (como APOBEC, AID o CDA)2, una forma alterada de Cas9 capaz de cortar la hebra de ADN sin edición de base, una o más unidades del péptido inhibidor de la uracilo glicosilasa (UGI) y una secuencia de localización nuclear (NLS)1,2,3. Estos componentes normalmente se fusionan de forma covalente, pero también se pueden ensamblar de forma no covalente4. Los CBE se han explotado ampliamente para la reversión de genes y la ingeniería celular y tienen el potencial de brindar beneficios terapéuticos a los pacientes que viven con enfermedades genéticas debilitantes o neoplasias malignas5.

Aunque se puede lograr una alta eficiencia de edición de ADN en el objetivo con las herramientas de edición de base CBE actuales2, también pueden causar una edición fuera del objetivo independiente del ARN guía (ARNg) estocástico en todo el genoma6,7. Se ha informado que los editores de CBE de última generación, como YE1 (ref. 8), BE4-PpAPOBEC9 y otros10, mitigan los resultados fuera del objetivo independientes del gRNA, pero estos editores usan variantes naturales o de ingeniería ligera de la desaminasa APOBEC y pueden sufrir una disminución en -rendimiento de edición objetivo2,9. Además, en algunos contextos específicos de secuencia, los CBE basados ​​en APOBEC pueden conducir a la edición proximal adyacente a la secuencia genómica objetivo debido a la capacidad ineficiente, pero medible, de APOBEC para aceptar ADN de doble cadena (dsDNA) como sustrato11.

Los editores de base de adenina (ABE) son enzimas de edición de genes que instalan de forma programable mutaciones puntuales de A·T a G·C en loci específicos a través de una desaminasa TadA desarrollada en laboratorio que convierte químicamente la adenina en inosina12. Los pares de bases de inosina con citosina dentro del sitio activo de las ADN polimerasas dan como resultado una mutación de inosina a guanina después de la replicación del ADN. En particular, los ABE causan pocos o ningún objetivo fuera del objetivo independiente del gRNA y editan el ADN genómico (gDNA) dentro de una ventana más precisa (posiciones ~3–8, PAM 21–23), lo que puede resultar en menos objetivos fuera del objetivo dependientes de la guía como así como menos ediciones de espectadores, en relación con CBE6,13. Además, no se ha informado que los ABE actúen sobre el dsDNA.

Para conferir los atributos favorables de los ABE a un CBE, imaginamos transformar TadA en una enzima capaz de desaminación de citidina robusta y, posteriormente, generamos una clase mejorada de CBE que usa TadA en lugar de una citidina desaminasa natural. De manera alentadora, investigaciones previas han demostrado la maleabilidad de los ABE hacia una edición C a T baja, pero detectable, a través de la inclusión de UGI14. De hecho, a través del diseño guiado por la estructura, se informó una variante de ABE, ABE-P48R-UGI, que permitió una actividad de citosina mejorada, en relación con ABE7.10, pero con una alta especificidad de secuencia de TC15. Si bien estos avances representaron un progreso hacia nuestros objetivos, reconocimos que se requeriría una mayor ingeniería y evolución de TadA para lograr eficiencias de edición C·G-to-T·A terapéuticamente relevantes con alta pureza del producto y sin restricciones de secuencia de sustrato.

Comenzando con ABE8.20-m13 como plantilla para la generación de bibliotecas, llevamos a cabo dos rondas de evolución dirigida para generar variantes de editor base con eficiencias de edición mejoradas de C·G a T·A y retención de la edición de adenina. Nos referimos a estos editores de base de citosina y adenina (CABE) que utilizan TadA como 'CABE-Ts', y desarrollamos y caracterizamos aún más estos editores para las eficiencias de edición C·G-to-T·A y A·T-to-G·C en células de mamíferos. Con CABE-Ts en la mano, determinamos las estructuras cristalinas de las variantes de desaminasas TadA asociadas con estos editores y realizamos mutagénesis guiada por estructuras para crear CBE-Ts, una clase distinta de CBEs que usan desaminasas TadA modificadas genéticamente para altas C·G a T· Una conversión en gDNA sin niveles apreciables de edición de A·T a G·C. En relación con BE4, nuestros CBE-T demostraron eficiencias de edición en el objetivo comparables, tenían una ventana de edición más precisa, redujeron la edición fuera del objetivo dependiente de la guía y no mostraron una edición fuera del objetivo detectable en todo el genoma independiente del ARNg. Además, los CBE-T demostraron compatibilidad con las enzimas Cas ortogonales, lo que permitió su aplicación potencial en una gama más amplia de sitios objetivo. Finalmente, nuestros CBE-T fueron muy activos en tipos de células primarias como las células T y los hepatocitos, validando así su potencial como una herramienta atractiva de edición de genes para aplicaciones terapéuticas.

Para alterar la tolerancia al sustrato de la nucleobase de ABE, razonamos que podíamos presionar selectivamente a ABE para aumentar su baja, pero detectable13,14, capacidad de edición de bases C·G-a-T·A a través de la evolución dirigida y la inclusión de UGI (para inhibir el uracilo reparación por UNG2). Primero, generamos una biblioteca ABE químicamente aleatoria en la región TadA del editor (ABE8.20-m13 utilizada como plantilla) o aleatoria mediante PCR propensa a errores (ABE8.19-m13 utilizada como plantilla). La biblioteca resultante de ~10 millones de miembros contenía un promedio de tres sustituciones de aminoácidos por miembro. Escherichia coli se cotransformó con la biblioteca ABE, gRNA y un plásmido de selección y luego se desafió con dosis letales de antibiótico que se seleccionaron para los miembros de la biblioteca ABE que realizaron ediciones C·G a T·A dentro de una resistencia antibiótica correspondiente, restaurando el gen función (Fig. 1a-d y Secuencia complementaria 1). El análisis de secuencias de Sanger de los miembros de la biblioteca supervivientes (Fig. 1e y Fig. 1 complementaria) reveló que la mayoría de los clones seleccionados con antibióticos contenían sustituciones de aminoácidos en las posiciones 27 y 49 de TadA. Debido a que 19 de 20 variantes contienen al menos una sustitución en cualquier posición, planteamos la hipótesis de que las sustituciones en estas posiciones (E27H e I49K) ubicadas cerca del bolsillo de unión del sustrato inducirían cambios conformacionales que harían que TadA fuera capaz de unirse y desaminar la nucleobase de citosina, que es notablemente de menor tamaño que la adenina.

a, Descripción general esquemática del flujo de trabajo de evolución dirigida para identificar variantes de TadA capaces de desaminación de C a U. b, Representación esquemática de plásmidos de expresión y selección utilizados en campañas de evolución dirigida. Izquierda: miembro de biblioteca de codificación de plásmido de expresión de editor de base y sgRNA, derecha: plásmido de selección que codifica un gen de resistencia a antibióticos no funcional. La reversión en los sitios seleccionados restaura la función del gen. c, Descripción general del desarrollo del editor CBE-T a través de la evolución dirigida y la ingeniería de proteínas. d, Representación esquemática de arquitecturas de editor base seleccionadas. ABE12 contiene una desaminasa TadA* desarrollada en laboratorio, nCas9 (D10A) y una etiqueta de localización nuclear (bpNLS). El editor dual (por ejemplo, SPACE16) consta de una desaminasa TadA* evolucionada, nCas9 (D10A), citidina desaminasa rAPOBEC1 junto con dos unidades de UGI y una etiqueta bpNLS. Los CBE (por ejemplo, BE4 (ref. 3)) se componen de una citidina desaminasa natural (por ejemplo, rAPOBEC1), nCas9 D10A, dos unidades de UGI y una etiqueta bpNLS. Los CABE-T, informados aquí, se componen de una variante TadA capaz de editar de A a G y de C a T (TADAC), nCas9 (D10A), dos unidades de UGI y una etiqueta bpNLS. Los CBE-T, que se informan aquí, se componen de una variante TadA capaz de editar C-to-T (TADC), nCas9 (D10A), dos unidades de UGI y una etiqueta bpNLS. e, Sustituciones incorporadas en TadA en editores CABE-T seleccionados de la ronda 1 de evolución dirigida (CABE-T1) y la ronda 2 (CABE-T2). Las sustituciones incorporadas en TadA*8.20 relacionadas con TadA de tipo salvaje (WT) se resaltan en gris, y las identificadas en la ronda de evolución dirigida 1 y 2 se resaltan en violeta y naranja, respectivamente. Los valores de la última columna representan el número de sustituciones añadidas a cada variante en comparación con WT TadA. f, Máxima conversión de C·G a T·A y de A·T a G·C en células HEK293T transfectadas con plásmidos de expresión humana que codifican editores o controles CABE-T1 y CABE-T2. Los valores y las barras de error reflejan la media y la desviación estándar de n = 3 (sitios 1–4) o 4 (sitios 5 y 6) réplicas biológicas independientes realizadas en diferentes días.

Datos fuente

De los miembros de la biblioteca supervivientes, 20 variantes se caracterizaron en células de mamíferos para obtener resultados de edición básicos y muchas variantes identificadas desde la primera ronda de evolución demostraron niveles apreciables de edición C·G a T·A (por ejemplo, CABE-T1.2, avg 32,1 %; CABE-T1.17, promedio de 34,9 % en 22 sitios genómicos), con varios grados de edición de A·T a G·C conservados (Fig. 1f y Figs. complementarias 2–4). Arquitectónicamente, estos editores básicos se componen de una variante TadA fusionada covalentemente al extremo N-terminal de una nickasa Cas9 (nCas9, D10A) seguida de dos unidades UGI C-terminal y una etiqueta de localización nuclear (Fig. 1d). En consecuencia, nos referimos a estos editores duales A·T a G·C y C·G a T·A como CABE-T1 (Fig. 1c). Los CABE-T1 obtuvieron un aumento promedio de edición de C·G a T·A >25 veces mayor que ABE8.20-m en los sitios genómicos probados (Fig. 1f y Figs. complementarias 2–4).

Para aumentar aún más la eficiencia de edición general de CABE-T1, creamos una biblioteca CABE-T de ~ 10 millones de miembros en la secuencia de fondo de CABE-T1.2, un CABE-T1 que demostró una sólida C·G a T·A edición en células de mamífero (Fig. 1f). Solicitamos a los miembros de la biblioteca CABE-T1.2 que crearan dos reversiones de C·G a T·A, además de dos ediciones de A·T a G·C para aumentar la rigurosidad en la selección, para sobrevivir a la exposición a antibióticos en concentraciones más altas que en el ronda anterior de evolución dirigida (Fig. 1b y Secuencia complementaria 2). Los miembros de la biblioteca sobrevivientes, denominados variantes CABE-T2, se identificaron en secuencia y evaluaron la eficiencia de edición de bases y el sesgo del sustrato de nucleobase en células de mamífero (Fig. 1e, f y Fig. 5 complementaria). En general, los experimentos de transfección en mamíferos revelaron una mejora en nuestros CABE-T2 con respecto a los CABE-T1. Por ejemplo, las variantes representativas CABE-T2.6, CABE-T2.9 y CABE-T2.19 pudieron lograr tasas de edición máximas promedio de C·G a T·A del 53,0 %, 53,6 % y 49,4 % en 22 sitios genómicos. , respectivamente, manteniendo también varios niveles de edición A·T a G·C (Fig. 1f y Figs. Suplementarias 2, 3 y 6).

Si bien los CABE se informaron anteriormente en la literatura, estas herramientas requirieron la inclusión de las desaminasas TadA * 7.10 y rAPOBEC1 para permitir la edición de la base de adenina y citosina desde un único editor completo16,17,18,19. La creación de CABE-T que usan una variante de TadA que actúa tanto en las adeninas como en las citosinas del ADN (TADAC) dio como resultado la generación de un editor de base más compacto (~700 pb más pequeño) con resultados de edición de base dual superiores en relación con los CABE descritos anteriormente. Por ejemplo, CABE-T2.6 demostró un máximo de C·G a T·A ~1,6 veces superior y un máximo de A·T a G·C ~2,6 veces superior en relación con SPACE16, A&C-BEmax17 y TargetACEmax18 (Fig. 1f y Figuras complementarias 2 y 3).

Para aclarar cómo las sustituciones de aminoácidos identificadas a partir de la evolución dirigida afectan la tolerancia al sustrato de TADAC, determinamos las estructuras cristalinas de TadA*8.20 de ABE8.20-m13, la plantilla utilizada para evolucionar CABE-T1, y las variantes de TADAC-1 de CABE-T1 que se informan aquí. . Mediante el uso de conocimientos estructurales, nuestro objetivo era optimizar la eficiencia de edición C·G-to-T·A y la especificidad del sustrato a través del diseño de bibliotecas guiadas por estructuras.

Después de la primera ronda de evolución dirigida, caracterizamos estructuralmente tres desaminasas correspondientes a CABE-T1 (TADAC-1.17, TADAC-1.14 y TADAC-1.19) que generaron niveles apreciables de edición de bases C·G a T·A. Aunque las estructuras generales de estas variantes son similares a las de TadA * 8.20 (Fig. 2a), los análisis estructurales revelaron cambios estructurales locales que pueden explicar la tolerancia al sustrato expandida observada exhibida por las variantes CABE-T1.

a, Superposiciones entre monómeros de TadA*8.20 y variantes de TADAC-1 (RMSD entre 0,4 Å y 0,9 Å para todos los átomos de Cα). Las estructuras TADAC-1.17 (proteína: azul, ssDNA: naranja) y TadA*8.20 (proteína: verde, ssDNA: amarillo) son similares (RMSD de 0,4 Å para todos los átomos de Cα), lo que demuestra que las sustituciones (esferas cian) ni cambiar la estructura de la proteína ni el modo de unión de ssDNA, pero puede afectar la catálisis debido a la sustitución del sitio activo S82T. La estructura TADAC-1.14 (amarillo) tiene una conformación diferente para el bucle entre β4 y β5 (magenta) que TadA*8.20 debido a la sustitución G112H (esfera magenta). La estructura TADAC-1.19 (rosa) tiene un bucle extendido entre α1 y β1 (naranja) con una conformación diferente a TadA*8.20 debido a la sustitución E27G (esfera naranja). C representa el C-terminal. b, Superficie de las cavidades del sitio activo de las variantes TadA*8.20 y TADAC-1. TADAC-1.17 (segundo panel) no muestra diferencias en comparación con TadA*8.20 (primer panel). El bucle TADAC-1.14 entre β4 y β5 (tercer panel) altera la forma de la cavidad del sitio activo, lo que hace que A109 choque estérico con dT(8) de TadA*8.20-ssDNA. El bucle TADAC-1.19 entre α1 y β1 (cuarto panel) altera la forma de la cavidad del sitio activo, lo que hace que el residuo R26 choque estérico con dC(10) de TadA*8.20-ssDNA. c, sitio activo de TADAC-1.17 con el análogo de estado de transición de adenina 2-desoxi-8-azanebularina (d8Az; amarillo) coordinado con el ion zinc (esfera gris). T82 está a 4 Å (línea discontinua cian) del residuo catalítico E59. Las líneas discontinuas negras indican enlaces de hidrógeno. d, Superposición entre monómeros TADAC-1.14 sin sustrato (amarillo claro y oscuro) y monómero TadA*8.20 unido a ssDNA (proteína: verde, ssDNA: amarillo) que muestra dos conformaciones diferentes para el bucle TADAC-1.14 entre β4 y β5 (rosa y magenta) en comparación con TadA*8.20. Este bucle contiene la sustitución G112H, y sus nuevas conformaciones provocarían choques estéricos con dT(8). K49 está cerca de la columna vertebral ssDNA (~ 4.5 Å de la columna vertebral dC (10)) y puede contribuir a estabilizar el complejo proteína-ADN. e, Superposición entre TADAC-1.19 sin sustrato (rosa) y monómeros TadA*8.20 unidos a ssDNA que muestra que la sustitución E27G coloca E25 en TADAC-1.19 (naranja) en una posición similar a E27 en TadA*8.20 (verde) e induce una nueva conformación para el bucle TADAC-1.19 entre α1 y β1 (naranja). Las líneas discontinuas indican enlaces de hidrógeno.

Las estructuras cristalinas de TadA*8.20 y TADAC-1.17 se determinaron en un complejo con sustrato de ssDNA que contenía el análogo de estado de transición de adenina 2-desoxi-8-azanebularina (d8Az) (Fig. 2, Datos extendidos Figs. 1 y 2 y Figs suplementarias 7–10). Estas dos estructuras son muy similares y las cuatro sustituciones de TADAC-1.17 (T17A, A48G, S82T y A142E) derivadas de la evolución no alteran drásticamente la tolerancia al sustrato al cambiar la estructura de la proteína o el modo de unión de ssDNA (Fig. 2a, b). Estos hallazgos se correlacionan con las reversiones de C·G a T·A relativamente bajas de TADAC-1.17 en el sitio genómico 5 en comparación con otras variantes en CABE-T1 (Fig. 4 complementaria). Presumimos que la cadena lateral T82 cerca del residuo catalítico E59 (~ 4 Å) en el sitio activo puede tener un papel en el aumento de la desaminación de citosina al modular la transferencia de protones hacia o desde E59 (Fig. 2c). Además, el enlace de hidrógeno entre E142 y R153 puede modular la unión de ssDNA al estabilizar la hélice α6, como lo ejemplifican las interacciones entre F156 y dT(8) en la estructura TADAC-1.17 (Datos extendidos Fig. 2d).

En particular, la estructura cristalina de TADAC-1.14 que contiene cuatro sustituciones (S2H, I49K, Y76I y G112H) revela una diferencia estructural en el bucle entre las hebras β4 y β5 (R107 a V130) en el lado derecho de la cavidad del sitio activo (Fig. 2a, d, Datos extendidos Fig. 3 y Fig. 11 complementaria). Este bucle contiene una sustitución G112H que altera drásticamente su flexibilidad y conformación en relación con TadA*8.20 mediante la introducción de un residuo voluminoso con carga positiva (datos extendidos, figura 3d). Estos cambios estructurales pueden remodelar la cavidad del sitio activo de TADAC-1.14 para acomodar tanto las adeninas como las citosinas (Fig. 2b y datos extendidos, Fig. 3f). De hecho, una comparación con la estructura de TadA * 8.20 unida al sustrato de ssDNA muestra que TADAC-1.14 puede participar en ssDNA de manera diferente a las variantes de TadA con especificidad de adenina estricta (Fig. 2b y Extended Data Fig. 3d). Presumimos que el residuo K49 dentro de TADAC-1.14 puede contribuir a la estabilización de las interacciones proteína-ADN requeridas para unir sustratos de ssDNA que contienen citosina debido a su reposicionamiento cerca de la nucleobase dC (10) (~ 4.5 Å) (Fig. 2d y Datos extendidos Fig. 3e).

Además de las perturbaciones en el lado derecho de la cavidad del sitio activo de TADAC-1.14, la evaluación de la estructura de TADAC-1.19 revela que otras sustituciones (E27G e I49N) de nuestra evolución causaron cambios estructurales importantes en el lado izquierdo de la cavidad del sitio activo. (Fig. 2a, b, Datos extendidos Fig. 4 y Fig. 12 complementaria). Es probable que estos cambios estructurales sean causados ​​por la sustitución de E27G, que da como resultado la pérdida de enlaces de hidrógeno esenciales entre E27 y A48, I49 y G50. Debido a estas pérdidas de enlaces de hidrógeno, ocurrió un cambio conformacional que reorientó el residuo E25 de TADAC-1.19 a una posición similar que antes ocupaba el residuo E27 en TadA*8.20 (Fig. 2e y Extended Data Fig. 4e). El desplazamiento de E25 acorta la hélice α1, cambia la longitud y la conformación del bucle entre α1 y β1 (D24 a P29) que contiene la sustitución E27G y despliega las hélices α5 y α6 (Fig. 2a,e y Extended Data Fig. 4), remodelando la cavidad del sitio activo de TADAC-T1.19 y afectando potencialmente la unión de la nucleobase objetivo dentro del sitio activo (Fig. 2b).

Informados por las estructuras cristalinas descritas aquí (Fig. 2), especulamos que los cambios estructurales inducidos por sustituciones en una de las tres regiones distintas de TadA * 8.20 (E27G, S82T y G112H) fueron suficientes para alterar la tolerancia del sustrato hacia una citosina (Fig. 3b). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la combinación de sustituciones de aminoácidos de las tres regiones produciría una mejora sinérgica en la mejora de la edición C·G a T·A. Para probar esta hipótesis, se seleccionaron ocho sitios dentro de la desaminasa de CABE-T1 para la construcción de la biblioteca, incluidas las sustituciones en las posiciones 27, 49, 82, 112 y 142 discutidas anteriormente, más dos sitios seleccionados racionalmente en o cerca del sitio activo de TadA* 8.20 (Fig. 3a,b) para generar la primera biblioteca combinatoria que contiene 199 variantes (CABE-T3). Cada miembro de la biblioteca tenía de 2 a 10 sustituciones de aminoácidos (~ 5.3 en promedio) en la desaminasa de CABE-T3, y la mayoría de los miembros de la biblioteca codificaron al menos una sustitución de aminoácidos en estas tres regiones (Fig. 3b, c y Figs. Suplementarias 13 y 14). Identificamos varias variantes de CABE-T3, en particular CABE-T3.1 y CABE-T3.155, que demuestran actividad de edición de base dual C·G-to-T·A y A·T-to-G·C en niveles comparables a o superiores a los de CABE-T1 o CABE-T2 (Fig. 3d y Figs. complementarias 2, 3 y 15). En particular, al seleccionar miembros de la biblioteca directamente en células de mamíferos para determinar la actividad de edición de base relativa, pudimos identificar editores con una amplia gama de proporciones de edición C·G a T·A y A·T a G·C, incluidas varias variantes (por ejemplo, CABE-T3.55, T3.153 y T3.154) capaz de una edición robusta de C·G a T·A con una edición mínima de A·T a G·C (Fig. 15 complementaria).

a, Flujo de trabajo de diseño de biblioteca combinatoria guiada por estructura. Para mayor claridad, solo se muestra un monómero TadA*8.20 (verde) con ssDNA (amarillo). Los 23 sitios de sustitución identificados en la primera ronda de evolución se muestran como esferas violetas en el primer panel. Con base en las estructuras de las variantes de TADAC-1 (Fig. 2), se seleccionaron 10 sitios, 8 de TADAC-1 (violeta) más 2 seleccionados racionalmente (cian), en el bucle entre α1 y β1, α2-hélice, sitio activo , el bucle entre β4 y β5 y α5-helix, para generar las variantes de TADAC-3 (segundo panel). Los sitios de sustitución en TADAC-2 de la segunda ronda de evolución se muestran como esferas violetas (los mismos sitios identificados en TADAC-1) y naranjas (nuevos sitios) en la estructura TadA*8.20 (tercer panel). Para generar las variantes de TADC-1, se agregaron ocho sustituciones de la segunda ronda de evolución a TACAC-3.154 (cuarto panel). b, Otra vista de la estructura TadA*8.20 (verde) que muestra los sitios de sustitución seleccionados para generar TADAC-3 (esferas violeta y cian). Los círculos discontinuos resaltan las tres regiones que suponemos que son críticas para alterar la tolerancia del sustrato. c, Sustituciones incorporadas en TadA seleccionados de la ronda 1 de pantalla guiada por estructura (editores CABE-T3; TADAC-3 deaminasas) y la ronda 2 (editores CBE-T1; TADC-1 deaminasas). Las sustituciones incorporadas en TadA*8.20 en relación con WT TadA se resaltan en gris, y las identificadas en las campañas de evolución dirigida 1 y 2 se resaltan en violeta y naranja, respectivamente. Los valores de la última columna representan el número de sustituciones añadidas a cada variante en comparación con WT TadA. d, conversión máxima de C·G a T·A y de A·T a G·C en loci genómicos específicos en células HEK293T transfectadas con plásmidos de expresión humana que codifican editores o controles de bases CABE-T3 y CBE-T1. Los valores y las barras de error reflejan la media y la desviación estándar de n = 3 (sitios 1–4) o 4 (sitios 5 y 6) réplicas biológicas independientes realizadas en diferentes días.

Datos fuente

En concordancia, para aumentar aún más la eficiencia general de edición de C·G-a-T·A y optimizar la especificidad del sustrato hacia la citosina, tomamos CABE-T3.154, un editor base que muestra una fuerte preferencia por la edición de C·G a T·A (Supplementary Figs. 14 y 15) y ocho sustituciones adicionales en capas combinatorias seleccionadas de las desaminasas de CABE-T2s (Fig. 3 y Figs. 5 y 6 complementarias). Estas sustituciones están ubicadas próximas al bolsillo de unión al ADN de la desaminasa y su inclusión en CABE-T2 provocó un aumento general en la eficiencia de edición en comparación con CABE-T1. Generamos una biblioteca de 56 miembros (Fig. 16 complementaria), los examinamos en células de mamíferos a través de la transfección de plásmidos y descubrimos que las 56 variantes lograron una edición sustancial de C·G a T·A (69,2% en promedio en todas las variantes) pero causaron solo niveles bajos a indetectables de edición de A·T a G·C (promedio del 1,8 % en todas las variantes en todos los sitios evaluados; Fig. 3d y Figs. complementarias 17 y 18). Por lo tanto, designamos estos CBE que contienen TadA que actúan sobre las citosinas de ADN (TADC) como CBE-T (Fig. 1d).

Después de observar la sólida actividad de nuestros CBE-T en Hek293T, teníamos curiosidad por evaluar cómo los resultados de la edición de la base de citosina de un subconjunto representativo de nuestros 56 CBE-T se comparan con el editor ABE-P48R-UGI15 publicado anteriormente en seis sitios genómicos dada la alto grado de sustitución de aminoácidos por variante que se requirió para acceder a nuestros editores (Fig. 1e y Fig. 16 complementaria). De hecho, descubrimos que nuestros CBE-T superaron en gran medida a ABE-P48R-UGI en la eficiencia de edición de C·G a T·A, la pureza relativa del producto de edición de citosina a la base de adenina y la tolerancia al sustrato (Fig. 19 complementaria). En relación con ABE-P48R-UGI, los CBE-T no se restringieron a motivos TC, una limitación del editor ABE-P48R-UGI y, por lo tanto, imaginamos que los CBE-T informados aquí tienen una aplicación más universal (Fig. 19 complementaria) .

Para determinar si los TADC presentes en nuestros CBE-T eran compatibles con las enzimas Cas ortogonales, analizamos la actividad de edición de base de un subconjunto representativo de nuestros CBE-T, reemplazando la nickasa Cas9 D10A de Streptococcus pyogenes con la nickasa Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9, PAM : NGGRRT), que previamente demostró tener compatibilidad con los editores ABE en células de mamíferos13,20. De hecho, observamos que las TADC son enzimas modulares y son compatibles con SaCas9, pero solo provocan eficiencias de edición modestas de C·G-a-T·A, similares a las variantes BE4-SaCas9, en los seis sitios genómicos probados (Fig. 20 complementaria).

Para caracterizar más profundamente los CABE-T y CBE-T, sintetizamos químicamente ARNg y ARNm transcritos in vitro (IVT) que codifican un subconjunto representativo de editores CABE-T y CBE-T y los transfectamos en células HEK293T en dosis de saturación y subsaturación de ARNm que codifica el editor (Fig. 4a, b). Para los CABE-T2 y T3 evaluados, observamos un aumento promedio de 1,53 y 1,03 veces en la edición máxima de C·G a T·A y una mejora promedio de 2,18 y 1,67 veces en A·T a G ·Edición C relativa a SPACE y A&C-BEmax, respectivamente (Fig. 21 complementaria). En todos los sitios evaluados, no observamos una diferencia significativa en los resultados de edición máximos para nuestros CBE-T caracterizados en relación con BE4 (P = 0,30, prueba Wilcoxon-Mann-Whitney U de dos colas) y una diferenciación notable de los resultados de edición en relación con el editor principal ABE8.20. En todos los sitios evaluados, nuestros CBE-T dieron como resultado un aumento promedio de 262 veces en la edición de C·G a T·A y una disminución concordante de 13 veces en la edición de A·T a G·C en relación con ABE8.20 en toda la edición ventana (Fig. 4a-c y Figs. Suplementarias 2 y 3).

a,b, Conversión máxima de C·G a T·A y de A·T a G·C en células HEK293T transfectadas con ARNm que codifica variantes centrales de CBE-T, más controles, en ocho loci genómicos específicos a través de ARNg sintéticos en saturación (500 ng ARNm) (a) y condiciones de subsaturación (62,5 ng de ARNm de construcción + 437,5 ng de ARNm transportador no traducido) (b). c, Cambio porcentual en las tasas de edición de C·G a T·A (izquierda) y A·T a G·C (derecha) entre las variantes CBE-T1 y ABE8.20 en cada posición del sitio de destino (PAM = posiciones 21–23) en ocho sitios genómicos probados (sitios 1 a 8; Tabla complementaria 3). d, Conversión mediana de C·G a T·A en cada posición de la ventana objetivo como se especifica en el eje x, con la numeración de la posición definida como el PAM designado como posiciones 21–23. Los valores de los mapas de color se determinaron a partir de transfecciones de ARNm en condiciones de saturación. Los valores y el error reflejan la media y la desviación estándar de n = 4 (condiciones de saturación) o 3 (condiciones de subsaturación) réplicas biológicas independientes realizadas en días diferentes.

Datos fuente

Para confirmar que nuestros CABE-T y CBE-T procedieron a través de un mecanismo de desaminación de C a U, empleamos un ensayo de desaminación de punto final in vitro para evaluar un subconjunto de editores como complejos de ribonucleoproteína (RNP) programados con gRNA que actúan sobre dsDNA sustrato En este ensayo, CABE-Ts y CBE-Ts resultaron en un promedio de ~30 % de desaminación de sustrato de C a U después de 24 h en el sitio objetivo, en comparación con ~58 % para BE4, sin A-to-U detectable. -I desaminación para los CBE-Ts evaluados (Datos Ampliados Fig. 5a). Además de la desaminación del sustrato C-to-U, los CABE-T también produjeron hasta un 35 % de desaminación A-to-I en el objetivo. En conjunto, estos datos brindan soporte bioquímico ortogonal para la actividad de desaminación de C a U de nuestros CABE y CBE que utilizan variantes de TadA. En un experimento separado, la constante de tasa de desaminación aparente de C a U (kapp, también denominada tasa) de CBE-T1.14 RNP en sustrato dsDNA se midió en 0,014 ± 0,006 min-1, mucho más lenta que la tasa de desaminación A-a-I para ABE8.20 RNP en dsDNA (0,17 ± 0,06 min−1; datos extendidos Fig. 5b), mientras que su tasa de corte para la hebra no objetivo se mantuvo casi idéntica (datos extendidos Fig. 5b y datos suplementarios Figs. 22 y 23).

A pesar de tener una tasa de desaminación más lenta in vitro, CBE-T y BE4 produjeron una desaminación total comparable de los sitios objetivo en transfecciones celulares realizadas durante 5 días (Fig. 4a,b). Planteamos la hipótesis de que, dado el tiempo suficiente, la edición total de C·G a T·A o la desaminación de C-a-U por CBE-T alcanzaría niveles comparables al BE4 cinéticamente más rápido. De acuerdo con esta observación, extender el tiempo de desaminación a 24 h in vitro condujo a una desaminación total comparable de C a U por CBE-T y BE4 (Datos extendidos Fig. 5a).

A continuación, evaluamos cómo la dosis de ARNm administrado afecta los resultados de edición de la base de citosina mediante la realización de transfecciones de células de mamíferos a niveles subsaturados de ARNm (Fig. 24 complementaria). En estas condiciones, los CBE-T mantuvieron entre un 55 % y un 70 % de eficiencia de edición máxima en comparación con las condiciones de saturación y se desempeñaron de manera similar o mejor en relación con los CBE basados ​​en APOBEC por sitio. Los editores representativos de CBE-T CBE-T1.14, CBE-T1.46 y CBE-T1.52 lograron tasas promedio máximas de C·G a T·A del 66 % en ocho sitios genómicos, en comparación con un promedio de 59 % de C·G a T·A logrado por BE4, y un promedio de ~35% C·G a T·A logrado por YE1 (Fig. 4b y Fig. 25 complementaria). También encontramos que los CBE-T causan niveles similares de formación de indel y ediciones de C a no T (Fig. 26 complementaria y Fig. 6a de datos extendidos). La pureza del producto y los resultados de indel comparables en relación con los CBE que utilizan citidina desaminasas probablemente se deban a los mecanismos de reparación de lesiones genómicas de uracilo, que es independiente de cómo se creó la lesión.

Al igual que los ABE, mostramos que CABE-T y CBE-T tienen una ventana de edición más estrecha en relación con BE4, con ediciones básicas restringidas aproximadamente a las posiciones 3–8 en el protoespaciador (Fig. 4c y Fig. 27 complementaria). Además, observamos que los CBE-T, en relación con los CBE basados ​​en APOBEC, generan menos mutaciones transeúntes porque, en promedio, existen menos C en la ventana de orientación estrecha del editor (Fig. 4d y Fig. 27 complementaria). Para aplicaciones terapéuticas, notamos que este aumento en la precisión de edición de bases es una característica atractiva cuando se consideran objetivos de enfermedades. En relación con esto, mientras que BE4 se ha caracterizado por actuar sobre el dsDNA próximo al protoespaciador debido a las tolerancias bajas pero detectables de APOBEC para dsDNA como sustrato, no observamos esta actividad de edición de dsDNA con nuestros CBE-T (datos extendidos Fig. 6b).

Para caracterizar la edición fuera del objetivo del ADN dependiente de gRNA de CBE-T y CABE-T, realizamos transfecciones de ARNm en células con varios gRNA para los cuales el perfil fuera del objetivo del gRNA se caracterizó previamente con Cas9 y editores base1,12,13 ,21. Encontramos que CBE-Ts y CABE-Ts tienen frecuencias de edición de bases fuera del objetivo dependientes de gRNA más bajas en todos los sitios examinados en relación con BE4 y BE4-PpAPOBEC, con disminuciones de 3,06 y 3,53 veces en el C·G máximo a T· Una edición, respectivamente, y niveles similares en relación con los de los editores fuera de objetivo mitigados YE1 y BE4-PpAPOBEC-H122A (datos extendidos, figura 7 y figuras complementarias 28 y 29).

Para evaluar la proporción de la edición de base independiente de la guía causada por CABE-T y CBE-T a BE4 (para la edición de C a T) o ABE8.20 (para la edición de A a G), realizamos la secuenciación del genoma completo (WGS) de forma clonal. células expandidas tratadas con ARNm que codifica un editor de bases y cuantificaron la tasa de mutación relativa de C·G a T·A o de A·T a G·C como se describió antes13 (Fig. 30 complementaria). Encontramos que tanto los CABE-T como los CBE-T no causaron una elevación significativa en los SNV de C·G a T·A en todo el genoma en relación con las muestras no tratadas, un patrón que también se informó para YE1 y BE4-ppAPOBEC-H122A (todos P> 0,05; prueba U de Mann-Whitney unilateral). Por el contrario, BE4 provocó un enriquecimiento medio de 3,8 veces para las ediciones de C·G a T·A sobre el control (P = 7,770e-05; prueba U de Mann-Whitney unilateral) y BE4-PpAPOBEC provocó 1,5 veces la media enriquecimiento en veces de C·G a T·A (P = 0,00147; prueba U de Mann-Whitney unilateral) (Fig. 5a)6,13. Los CABE-T y CBE-T tampoco causaron una elevación significativa en los SNV genómicos A·T a G·C (todos P > 0,05; prueba U de Mann-Whitney unilateral) (Fig. 5b) y desaminación estocástica en todo el genoma era indistinguible de las células no tratadas.

a, gráfico de razón de probabilidades para las mutaciones C a T en relación con todos los demás tipos de mutaciones en células editadas con CABE-T3.155, CABE-T2.19, CBE-T1.14, CBE-T1.46 y CBE-T1.52, BE4, YE1, BE4-PpAPO y BE4-PpAPO-H122A en comparación con células expandidas clonalmente no tratadas, con barras negras que representan la razón de probabilidad mediana para ese grupo de tratamiento (P = 0,8359, 0,7473, 0,9476, 0,8089, 0,9751, 7,770 × 10− 5, 0,9859, 0,00148 y 0,7473, respectivamente; prueba U de Mann-Whitney unilateral). Todas las n = 8 poblaciones de células expandidas de una sola célula biológicamente independientes se muestran para cada condición. b, Gráfico de razón de probabilidades para las mutaciones A a G en relación con todos los demás tipos de mutaciones en células editadas con CABE-T33.155, CABE-T2.19, CBE-T1.14, CBE-T1.46 y CBE-T1.52 y ABE8.20 en comparación con células expandidas clonalmente no tratadas, con barras negras que representan la razón de probabilidad mediana para ese grupo de tratamiento (P = 0,1641, 0,4796, 0,5204, 0,8607, 0,5204 y 0,2527, respectivamente; prueba U de Mann-Whitney unilateral). Todas las n = 8 poblaciones de células expandidas de una sola célula biológicamente independientes se muestran para cada condición. c, Cinética in vitro de la desaminación de A a I o C a U del mismo sustrato presentado como ssDNA a BE4, ABE8.20 y CBE-T1.14 en ausencia de gRNA. Se informan las constantes de tasa aparente de pseudo primer orden (kapp) obtenidas ajustando a un solo ajuste exponencial (media ± sd, n = 3 réplicas independientes). Ver datos de fuente de gel.

Datos fuente

Para iluminar las diferencias cinéticas en la desaminación de ssDNA, medimos constantes de tasa de desaminación aparente de pseudo primer orden (kapp) de volumen de negocios único de editores base que carecen de un ARN guía en sustrato de ssDNA in vitro. Medimos la tasa de desaminación de C a U por BE4 en 0,78 ± 0,02 min−1, ~11 veces mayor que la tasa de desaminación de A a I provocada por ABE8.20 (kapp = 0,071 ± 0,005 min− 1) para el mismo sustrato ssDNA (Fig. 5c y Fig. 22 complementaria). Esta diferencia en la tasa de desaminación de ssDNA respalda aún más las observaciones anteriores, y las observaciones informadas aquí, de que los CBE basados ​​en APOBEC pueden desaminar estocásticamente regiones monocatenarias del genoma. Encontramos que CBE-T1.14 catalizó la desaminación de C a U con kapp de 0.060 ± 0.006 min−1, una tasa indistinguible de la medida para la desaminación de A a I por ABE8.20 (Fig. 5c y Fig. 22) en el mismo sustrato ssDNA. En particular, el residuo catalítico permanece sin cambios entre ABE8.20 y CBE-Ts (Figs. 2c, 3a y Extended Data Figs. 1d, 2, 3c).

Los CBE-T tienen un potencial sustancial para el uso terapéutico en la reversión y el silenciamiento de genes debido a sus propiedades mejoradas en relación con los CBE que utilizan citidina desaminasas naturales. Para evaluar el potencial de edición de CBE-T en células primarias, primero evaluamos la capacidad de CBE-T para silenciar la expresión de PCSK9, un objetivo relevante para el tratamiento terapéutico de la hipercolesterolemia22, en un sistema de cocultivo de hepatocitos humanos primarios de larga duración23. La desactivación o desactivación del gen PCSK9 da como resultado niveles más bajos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en la sangre y, posteriormente, reduce el riesgo de enfermedad cardíaca24,25. De hecho, se han logrado resultados prometedores con la orientación del sitio de empalme de PCSK9 con ABE8.8 in vivo26. De manera similar, encontramos que la transfección de ARNm de CBE-T1.46 con guía sintética dirigida al gen PCSK9 en hepatocitos humanos primarios logró eficiencias de edición de base C·G a T·A que son comparables o mayores que BE4 en dos sitios objetivo de PCSK9 que introducen el codón de parada Q555X o interrumpir el empalme de ARNm previo en el exón 4 (empalme E4; Fig. 6a). La evaluación de los niveles de proteína PCSK9 a través de ELISA muestra la eliminación de PCSK9 por CBE-T1.46 a niveles comparables o superiores a BE4 en ambos sitios objetivo probados (Fig. 6b). En concordancia, se observaron aumentos en el receptor de LDL total (LDLR) para las muestras tratadas con CBE-T1.46 en ambos sitios (P < 0,05, <0,01), lo que demuestra el potencial de CBE-T para generar un efecto fenotípico terapéuticamente relevante (Fig. 6c).

a, Resultados de edición de genes de hepatocitos humanos primarios transfectados con ARNm que codifican CBE-T1.46 y BE4 en tres sitios dentro del gen PCSK9 (izquierda, P = 0,2882 (NS); derecha, P = 0,0017 (doble asterisco)). Edición posicional dentro del protospacer indicado. b, Evaluación del cambio relativo en la secreción de PCSK9 entre el día 9 (momento de recolección) y el día 0 (momento de transfección) a través de ELISA. El sitio PCSK9 objetivo se indica en el eje x. Los valores de P son los siguientes: Q555X frente a no tratado, P = 0,001001 (doble asterisco); Empalme E4 versus no tratado, P = 0,001295 (doble asterisco). c, Cambio relativo en LDL-R presente en el sobrenadante entre el día 9 y el día 0 evaluado por ELISA. Los valores de P son los siguientes: Q555X frente a no tratado, P = 0,001116 (doble asterisco), empalme E4 frente a no tratado, P = 0,009481 (doble asterisco). d, Eficiencias de edición de genes de las pantallas de sgRNA en células T humanas primarias usando CBE-T. La etiqueta del eje X indica el gen objetivo y la base objetivo dentro del sgRNA. e,f, Porcentaje de conversión de C·G a T·A (e) y pérdida de proteína de superficie (f) logrado por cada editor base o control en células T humanas primarias editadas multiplex. Los datos de hepatocitos primarios se generaron a partir de n = 3 ('ninguna'/muestras no tratadas) o 4 (muestras BE4 y CBE-T1.46) réplicas biológicas independientes. Los datos de células T se generaron a partir de n = 2 donantes independientes. Cuando correspondía, la significación estadística se calculó mediante pruebas t no pareadas de dos colas: NS, P ≥ 0,05; *P < 0,05; ** P < 0,01.

Datos fuente

A continuación, evaluamos la aplicación de CBE-T a la ingeniería de células T terapéuticas. Las terapias de células T autólogas derivadas de células T que expresan TCRαβ son efectivas en el tratamiento de algunos tipos de cáncer, aunque la fabricación de estas terapias celulares por paciente puede resultar en productos inconsistentes, alto costo de los productos y retrasos significativos en el tratamiento del paciente. La edición de genes se puede utilizar para crear terapias de células T universalmente compatibles, generadas a partir de donantes únicos para el tratamiento de muchos pacientes27. Las terapias de células T universalmente compatibles requieren el silenciamiento multigénico para eliminar la expresión del receptor de células T para reducir el potencial de enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y estrategias de edición para reducir o eliminar el rechazo del huésped a las células T alogénicas28. Para determinar si los CBE-T podrían usarse para la edición de células T, electroporamos células T con ARNm que codifican CBE-T y ARNg dirigidos a genes que codifican componentes del receptor de células T, B2M o CIITA y descubrimos que los CBE-T produjeron resultados comparables o solo Eficiencias de edición ligeramente más bajas en comparación con los controles BE4 (Fig. 6d). La edición multiplexada de CBE-T demostró eficiencias de edición comparables en comparación con la edición de un solo plex, lo que dio como resultado niveles correspondientes de eliminación de proteínas (Fig. 6e, f y Fig. 31 complementaria), lo que demuestra el potencial de la plataforma CBE-T para fines terapéuticos. ingeniería celular.

Aquí describimos el desarrollo de dos familias de editores base, CABE-T y CBE-T, que usan variantes de TadA para catalizar la desaminación de citosinas con retención (CABE-T) o pérdida (CBE-T) de desaminación de adenina.

En el transcurso de diez rondas totales de evolución dirigida y rondas adicionales de diseño guiado por la estructura, TadA ha madurado para incluir más de 29 sustituciones en nuestros CBE-T más diseñados (Fig. 3c). A través de la cristalografía de rayos X, mostramos cómo la acumulación de sustituciones afecta la forma de la cavidad del sitio activo y puede contribuir a la acomodación de la citosina como sustrato y el cambio posterior en la especificidad hacia la desaminación de C a U. Las estructuras desarrolladas aquí ilustran cómo las sustituciones de aminoácidos en TadA influyen en los resultados de edición de genes observados en las células.

Los CABE-T y CBE-T informados aquí son editores de base de precisión con resultados fuera del objetivo de ADN independientes de la guía altamente mitigados, menos ediciones de espectadores y menos objetivos fuera del objetivo de ADN dependientes de la guía en relación con los CBE informados anteriormente debido a la diferencia en la cinética de desaminación de ssDNA por la variante TadA utilizada en nuestras construcciones CBE-T. Los CBE-T y CABE-T basados ​​en TadA retienen una alta actividad de edición en el objetivo, lo que permite una alta eficiencia de edición de genes tanto en aplicaciones simples como multiplexadas.

Finalmente, mostramos que nuestros CBE-T son activos en tipos de células terapéuticamente relevantes, incluidos los hepatocitos primarios y las células T primarias, con resultados de edición similares o superiores a los que se pueden lograr con BE4. Demostramos la capacidad de CBE-T para editar sitios objetivo en el locus PCSK9 para reducir los niveles de proteína PCSK9 secretada, así como para lograr altos niveles de edición multiplexada en objetivos de células T relevantes para la generación de células CAR-T alogénicas.

En resumen, el desarrollo de TadA para su uso en la edición de base de citosina altamente eficiente representa un avance impactante en el desarrollo de CBE como herramientas terapéuticas. Junto con los ABE, los CABE-T y los CBE-T permiten la instalación programable de todas las mutaciones de transición del ADN dentro de las células vivas, por separado o al mismo tiempo, mediante el uso de desaminasas TadA desarrolladas en laboratorio y de alta ingeniería y, en consecuencia, amplían las posibles aplicaciones terapéuticas de la base de citosina. edición.

Todos los métodos de biología molecular y los pasos de clonación se realizaron como se describió anteriormente13, incluida la utilización de la enzima USER (New England Biolabs, NEB, M5505L), Phusion U DNA Polymerase Green Multiplex PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, F564L), Q5 Hot Start High -Fidelity 2X Master Mix (NEB, M0494L), células competentes Mach T1 (Thermo Fisher Scientific, C8681201) y kits ZymoPURE II Plasmid Midiprep (Zymo Research Corporation, D4201) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Las secuencias de aminoácidos para los editores de base resaltados en este estudio se pueden encontrar en las Secuencias complementarias 3–31. Las secuencias de sgRNA utilizadas para apuntar a sitios genómicos se pueden encontrar en la Tabla complementaria 3. Los CABE-T y CBE-T representativos utilizados en este estudio se han depositado en Addgene.

Las bibliotecas sintéticas para las rondas de evolución dirigida uno y dos se obtuvieron de Ranomics con las siguientes especificaciones: ronda de evolución biblioteca TadA*8.20: cada posición de aminoácido de la secuencia TadA*8.20 (de ABE8.20) debe estar representada por los 20 aminoácidos sustituciones con una frecuencia de 1 a 3 sustituciones por miembro de la biblioteca (~10 millones de miembros). Esta biblioteca excluyó todas las secuencias de terminación y usó solo un codón por aminoácido. Esta biblioteca sintética se combinó con una biblioteca aleatoria generada con PCR propensa a errores usando TadA*8.19 (ref. 13) como plantilla, como se informó anteriormente en la ref. 12. Biblioteca sintética de la segunda ronda de evolución: cada posición de aminoácido de la secuencia TADAC1.02 se representará mediante las 20 sustituciones de aminoácidos a una frecuencia de 2 a 3 sustituciones por miembro de la biblioteca (~10 millones de miembros). Estas bibliotecas se clonaron en un plásmido de expresión bacteriano que contenía Cas9 muerto (dCas9 D10A y H840A) junto con gRNA dirigidos al gen de resistencia al cloranfenicol a través de la clonación USER.

La evolución dirigida de la biblioteca TadA8.19 y TadA8.20 (evolución dirigida ronda uno) y la biblioteca TADAC1.02 (evolución dirigida ronda 2) se realizó como se describió previamente en la ref. 13 con los siguientes cambios: las bibliotecas de varias variantes de desaminasa TadA* que están incluidas en un plásmido bacteriano que contiene la arquitectura del editor TadA*-dCas9-UGI fueron desafiadas a revertir las ediciones en el gen de resistencia al cloranfenicol para sobrevivir al tratamiento con dosis letales de antibiótico. En la primera ronda de evolución dirigida, la biblioteca de evolución era una combinación de una biblioteca ABE8.19m TadA* propensa a errores y una biblioteca sintética ABE8.20m TadA* donde cada posición de aminoácido está representada por las 20 sustituciones a una frecuencia de 1 –3 sustituciones por miembro de la biblioteca. Para superar el desafío del antibiótico, se necesitaron 2 reversiones de C a T (reversión de prolina y reversión de His del sitio activo). En la segunda ronda de evolución, se utilizó una biblioteca sintética de CABE-T1.2, que se generó con las especificaciones de la biblioteca ABE8.20 TadA* pero con 2 o 3 sustituciones por miembro de la biblioteca. Para superar el desafío del antibiótico, se necesitaron las mismas 2 reversiones de C a T más 2 reversiones de codón de PARADA de A a G.

Se cultivaron células HEK293T (ATCC, CRL-3216) en DMEM + GlutaMAX (Gibco, 10569) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (vol/vol) (Gibco, 10437) a 37 °C y CO2 al 5 % de acuerdo con protocolos estándar de la ATCC y como se describió anteriormente.13

Para todas las transfecciones, se sembraron células HEK293T a una densidad de 3,0 × 105 células por pocillo en placas de 48 pocillos recubiertas con poli-d-lisina BioCoat (Corning, 356509) 16–22 h antes de la transfección. Las transfecciones de plásmidos se realizaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) como se describió anteriormente.13 Las transfecciones con ARNm se realizaron con Lipofectamine MessengerMAX de acuerdo con los protocolos del fabricante, con las siguientes especificaciones: 500 ng (para condiciones de saturación) o 62,5 ng (subsaturación). condiciones) de ARNm que codifica para editor o control y 100 ng de ARNg sintético se combinaron en 12,5 μl de volumen total de medio reducido de suero OptiMEM (Gibco, 31985). A continuación, se añadió una mezcla de MessengerMAX de 12,5 μl 1:12,5 (Lipo:OptiMEM) a la solución de mRNA/gRNA, y todo el contenido se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 min. Para transfecciones de ARNm en condiciones de subsaturación, también se añadieron 437,5 ng de ARNm transportador para mantener cantidades equivalentes de material transfectado. A continuación, se usó toda la mezcla de 25 μl para tratar las células HEK293T presembradas. Las secuencias de sgRNA utilizadas en este estudio se especifican en la Tabla complementaria 3. Los gRNA sintéticos para transfecciones de mRNA tienen modificaciones en los extremos 5′/3′ como se describió anteriormente.13

Después de 4 días de incubación, se recolectó ADNg de células HEK293T de las células utilizando 100 μl de tampón de extracción de ADN de extracción rápida (Lucigen, QE09050) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para las células T alogénicas, se usaron 50 μl de tampón de extracción de ADN Quick Extract en 1 × 105 células a los 5–6 días posteriores a la transfección. Las muestras de ADN genómico de muestras de células de mamíferos se amplificaron con cebadores para la amplificación de ADN genómico específico del sitio que contenían secuencias adaptadoras compatibles con el sistema TruSeq HT de Illumina (secuencia de lectura del adaptador 1, AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA; lectura del adaptador 2, secuencia AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT). Las secuencias de estos cebadores se enumeran en la Tabla complementaria 4. Específicamente, se agregaron 2 μl de gDNA a una mezcla de reacción de PCR que contenía Phusion U Green Multiplex Master Mix (Thermo Fisher Scientific, F564L) y 0,5 μM de cada cebador directo e inverso. Luego, estos amplicones se codificaron con barras utilizando Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix, donde se agregaron 2 μl de amplicón de la primera ronda de PCR a la mezcla maestra que contenía 0,5 μM de cada combinación única de cebador de código de barras directo e inverso. Las condiciones de termociclado son las siguientes: 95 °C × 2 min de desnaturalización inicial; 95 °C × 15 s de ciclo de desnaturalización; 62 °C × 20 s de recocido; 72 °C × 20 s de extensión, con repeticiones de ciclo de 30 para la generación inicial de amplicón y 10 para código de barras. Los amplicones con código de barras se purificaron, el tamaño se seleccionó mediante electroforesis en gel y se extrajeron en gel con el kit de extracción en gel Qiaquick (Qiagen, 28706x4), y las concentraciones de ADN resultantes se evaluaron con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific).

Todos los datos NGS de amplicón objetivo se analizaron utilizando los métodos descritos anteriormente, incluido el uso de las siguientes herramientas/software: trimmomatic (v0.39), bowtie2 (v2.35), samtools (v1.9) y bam-readcounts (v0.8 ).13

Los archivos FASTQ se alinearon con el genoma humano (ensamblaje primario Gencode GRCh38v31) utilizando BWA mem2 (bwa-mem2-2.2.1). Las alineaciones se ordenaron por coordenadas, se combinaron si fue necesario y los duplicados se marcaron con Picard (v2.21.7) en la configuración predeterminada. A continuación, se realizó la recalibración de la puntuación de calidad base mediante GATK (v4.1.4.1) para crear un archivo BAM para introducirlo en LoFreq (v2.1.5) para la llamada de variantes. La muestra a granel 1 se usó como muestra normal y cada célula expandida clonalmente se analizó como una muestra de tumor separada para identificar mutaciones somáticas específicas de cada célula. LoFreq se ejecutó con el indicador '–min-cov 10' para requerir una cobertura mínima de diez veces en el sitio de la variante y las variantes somáticas se analizaron desde el archivo de salida somatic_final_minus-dbsnp.snvs, para eliminar las variantes comunes que probablemente eran falsos positivos.

Para las gráficas de razón de probabilidades, se requiere una sola célula representativa de las células expandidas clonalmente sin tratar como punto de referencia para comparar con las células tratadas y no tratadas para las desaminaciones C-to-T y A-to-G. Esta celda se seleccionó ordenando las células no tratadas por proporción de mutaciones A a G y proporción de mutaciones C a T y seleccionando la celda más cercana a la mediana para ambas métricas. N1 estaba en la posición 5/8 para las mutaciones de C a T y en la posición 3/8 para las mutaciones de A a G, lo que la convierte en la mejor candidata para la célula de referencia en los tratamientos CABE-T y CBE-T.

La proteína TadA*8.20 se clonó en un vector pET51b+ con etiquetas His y SUMO en el extremo N y se expresó en células E. coli BL21 Star (DE3) (NEB, C2527I) en medio LB. Los cultivos celulares se cultivaron a 37 °C con agitación a 240 rpm, y la expresión de proteínas se indujo con IPTG 0,5 mM cuando la DO600 alcanzó 0,6. El cultivo celular se incubó con agitación a 18 °C durante la noche. Las células recolectadas se lisaron mediante un homogeneizador de alta presión en tampón de lisis (Bis-Tris 25 mM, NaCl 500 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 % (vol/vol), pH 6,0 y PMSF 1 mM), y el lisado celular se clarificado por ultracentrifugación. Los lisados ​​clarificados se cargaron en resina de agarosa Ni-NTA mediante unión por lotes durante 1 hora a 4 °C. La resina se lavó con tampón de lisis con imidazol 20 mM en una columna de flujo por gravedad seguido de elución con el tampón de lisis complementado con imidazol 50/100/250 mM. La muestra eluida se incubó con Ulp1 mientras se dializaba en Bis-Tris 25 mM, NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 % (vol/vol) y pH 6,0 durante la noche. La muestra dializada se cargó en resina Ni-NTA para eliminar la proteína no escindida y Ulp1. El flujo de Ni-NTA inverso se cargó en una columna de Heparina HP de 5 ml (Cytiva) y se eluyó usando un gradiente de NaCl de 0 a 2 M. Las fracciones que contenían la proteína TadA*8.20 se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaños en Superdex75 10/300 en Bis-Tris 25 mM, NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 % (vol/vol), pH 7,0. La proteína TADAC-1.14 se expresó con la etiqueta His N-terminal en el vector pET51b+ y se purificó como se describió anteriormente, excepto que se omitieron la escisión de la etiqueta Ulp1 y los pasos Ni-NTA inversos. TADAC-1.17 y TADAC-1.19 se clonaron en el vector pD881 (ATUM) con etiqueta His N-terminal y etiqueta SUMO y se expresaron en células E. coli BL21 (NEB). La expresión de proteínas se indujo con ramnosa al 0,2 % (peso/vol) a una DO600 de 0,6, seguida de incubación a 37 °C durante 4 h. La purificación se realizó como se describe anteriormente. Estas variantes de desaminasas se utilizaron para estudios de cristalografía de rayos X. Todas las proteínas editoras de bases CBE-T utilizadas para estudios bioquímicos se expresaron y purificaron como se describe anteriormente con ligeras modificaciones.

La condición de cristalización de TadA*8.20 con ssDNA que contiene el análogo de adenina 2-desoxi-8-azanebularina (d8Az), 5′-G(1)C(2)T(3)C(4)G(5)G(6) )C(7)T(8)d8Az(9)C(10)G(11) G(12)A(13)-3′, fue identificado y optimizado utilizando un robot Mosquito (SPT LabTech) a 20 °C. Las gotas se prepararon mezclando 1 μl de proteína más solución de ssDNA (0,15 mM TadA*8,20 en 25 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (vol/vol) de glicerol, pH 7 y 0,22 mM ssDNA con d8Az ) y 1 μl de solución de depósito (27–29 % (vol/vol) PEG 3350, 0,22–0,26 M acetato de amonio, 0,1 M Tris pH 8,5) y equilibrado con 70 μl de solución de depósito. Los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora (glicerol al 15 % (vol/vol), PEG 3350 al 29 % (vol/vol), acetato de amonio 0,26 M, Tris 0,1 M pH 8,5) y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

La condición de cristalización de TADAC-1.17 con ssDNA que contiene el análogo de adenina 2-desoxi-8-azanebularina (d8Az), 5′-G(1)C(2)T(3)C(4)G(5)G(6) )C(7)T(8)d8Az(9)C(10)G(11) G(12)A(13)-3′, fue identificado y optimizado utilizando un robot Mosquito (SPT LabTech) a 20 °C. Las gotas se prepararon mezclando 1 μl de proteína más solución de ssDNA (0,15 mM TADAC-1.17 en 25 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (vol/vol) de glicerol, pH 7 y 0,22 mM ssDNA con d8Az ) y 1 μl de solución de depósito (4–8 % (vol/vol) PEG 3350, 8–10 % Tacsimate pH 6) y equilibrado con 200 μl de solución de depósito. Los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora (12% (vol/vol) PEG 3.350, 10% (vol/vol) Tacsimate pH 6, 25% (vol/vol) glicerol) y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

La condición de cristalización de TADAC-1.14 sin ssDNA (TADAC-1.14-holo) se identificó y optimizó utilizando un robot Mosquito (SPT LabTech) a 20 °C. Las gotas se prepararon mezclando 1 μl de solución de proteína (TADAC-1.14 0,18 mM en Bis-Tris 25 mM, NaCl 450 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 % (vol/vol), pH 7) y 1 μl de solución reservorio ( sulfato de amonio 1,8–2,0 M, HEPES 0,1 M pH 7,5) y se equilibró frente a 200 μl de solución de depósito. Los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora (sulfato de amonio 1,8 M, HEPES 0,1 M pH 7,5, 20% (vol/vol) de glicerol) y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

La condición de cristalización de TADAC-1.19 sin ssDNA (TADAC-1.19-holo) se identificó y optimizó utilizando un robot Mosquito (SPT LabTech) a 20 °C. Las gotas se prepararon mezclando 1 μl de solución de proteína (TADAC-1.19 0,3 mM en Bis-Tris 25 mM, NaCl 300 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 % (vol/vol), pH 7) y 1 μl de solución reservorio ( 6–12 % (vol/vol) PEG 3350, citrato de amonio 0,3–0,5 M tribásico pH 7,0) y equilibrado frente a 200 μl de solución de depósito. Los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora (16 % (vol/vol) de PEG 3.350, citrato de amonio 0,6 M tribásico pH 7,0, 20 % (vol/vol) de glicerol) y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

Las recopilaciones de datos se realizaron en la línea de luz Frontier Microfocusing Macromolecular Crystallography (FMX) de National Synchrotron Light Source II o la línea de luz ID30B de European Synchrotron Radiation Facility, o la línea de luz BL13-XALOC del ALBA Synchrotron o la línea de luz P13 de EMBL Hamburg en el anillo de almacenamiento PETRA III (DESY). Los datos de difracción se procesaron con XDS29 y se escalaron con AIMLESS30. Las estructuras cristalinas de TadA*8.20, TADAC-1.17, TADAC-1.14 y TADAC-1.19 sin o con ssDNA se determinaron mediante técnicas de reemplazo molecular implementadas en Phaser31. Para la estructura TadA*8.20, se utilizaron las coordenadas de la estructura TadA de E. coli (código del Banco de Datos de Proteínas (PDB): 1Z3A)32 para obtener las fases iniciales. Para las estructuras TADAC-1.17, TADAC-1.14 y TADAC-1.19, se utilizaron las coordenadas de TadA*8.20 (este estudio) para obtener las fases iniciales. Después del reemplazo molecular, se realizó un recocido simulado en phenix.refine33 para eliminar el sesgo del modelo. Los modelos se refinaron mediante rondas iterativas de construcción de modelos y la adición de moléculas de agua utilizando Coot34. El refinamiento de las estructuras en phenix.refine usó restricciones de simetría no cristalográficas, refinamiento posicional y de factor B y TLS (traslación, libración y tornillo) (excepto para TADAC-1.17 y TADAC-1.14). Los cristales de TadA*8.20 y TADAC-1.17 se maclan meroédricamente con fracciones de maclas de 0.375 y 0.246 mediante análisis de Britton (phenix.xtriage), respectivamente, y se usó la ley de maclas -h,-k,l en el refinamiento. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla complementaria 2. Los residuos y nucleótidos visualizados en las estructuras, de 167 residuos y 13 nucleótidos, se enumeran en la Tabla complementaria 5. Las figuras se crearon con el software PyMol (Schrodinger, 2010. The PyMOL Molecular Sistema de gráficos, versión 2.4.1.).

El sgRNA (mG*mA*mA*CACAAAGCAUAGACUGCGUUUUAGAGCUAGAAAAUAGC

AAGUAAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU; modificaciones: m, 2′-O-metilo y *, enlace fosforotioato) se sintetizó en Agilent Technologies e Integrated DNA Technologies (IDT). El sustrato de ADN se sintetizó en IDT: la cadena de ADN sometida a desaminación (TTCGGTGGCTCCGTCCGTGAACACAAAGCATAGACTGCCGGCGTTTTGGTTGCTCTTCG) se marcó con fluoróforo 5′ ATTO-647 y una cadena de ADN complementaria sometida a corte por D10A-Nickase (CGAAGAGCAACCAAAACGCCGGCAGTCTATGCTTTGTGTTCACGGACGGAGCCACCGAA) se marcó con 5 Fluoróforo '6-FAM. Para la desaminación independiente del ARN guía, se usó el ADN monocatenario marcado con ATTO-647 tal cual. Para la desaminación dependiente del ARN guía, se preparó sustrato de dsDNA hibridando las dos hebras, con el doble de exceso de la hebra experimentando mellas (1:2 nmol). El ADN duplicado se purificó mediante PAGE nativo al 7,5 % (29:1, acrilamida:bisacrilamida; Sigma). La banda de acrilamida que contenía el dsDNA se cortó, se trituró y se hizo girar durante la noche en tampón de trituración y remojo (NaCl 400 mM y EDTA 25 mM) para eluir el dsDNA. El dsDNA eluido se precipitó a –20 °C durante 2 h después de agregar 1 volumen de 2-propanol al 100 %, seguido de centrifugación a 20 000 g durante 30 min a 4 °C. El sedimento de ADN se lavó con 1 volumen de etanol al 70 % vol/vol y se centrifugó a 20 000 g durante 30 min a 4 °C. El sedimento se secó al aire a temperatura ambiente durante 30 min y se resuspendió en agua.

Los complejos RNP se formaron mezclando el sgRNA y la proteína editora de bases adecuada en una proporción molar de 1,5:1 en 'tampón de reacción y montaje de RNP' (HEPES-KOH 20 mM pH 7,4, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 5 % vol/ vol glicerol, TCEP 2 mM) e incubando a temperatura ambiente durante 20 min.

Para la cinética de recambio único de la desaminación de ADNdc dependiente de ARN guía in vitro, a una concentración final de RNP de 1 µM, se añadió una concentración final de sustrato de ADNdsd 10 nM (preparado a 100 nM en el ensamblaje de RNP y el tampón de reacción) para iniciar la desaminación. La reacción se incubó a 37 °C y se extrajeron alícuotas de 5 µl en los intervalos de tiempo indicados. Las reacciones se extinguieron en 50 µl de tampón de extinción (Tris–Cl 50 mM, pH 8,5, NaCl 400 mM, EDTA 25 mM, SDS al 0,1 %, 1 µl de proteinasa K termolábil (New England Biolabs, NEB P8111S) y 1 µl de 15 mg de ml−1 coprecipitante Glycoblue (Thermo Fisher Scientific, A9515)) durante 15 min a 37 °C. La proteinasa K termolábil se inactivó a 75 °C durante 15 min.

Los puntos de tiempo de reacción extinguidos luego se precipitaron con 2-propanol como se describe anteriormente. Para detectar adenina desaminada (inosina) catalizada por ABE, los puntos de tiempo precipitados se trataron con endonucleasa V como se describió anteriormente en las refs. 20,35. Para detectar citidina desaminada (desoxiuridina) catalizada por CBE, los puntos de tiempo precipitados se trataron con USER II (NEB, M5508L) de acuerdo con las pautas del fabricante. Las muestras se mezclaron con un volumen igual de tampón de carga de gel de formamida (formamida al 95 %, EDTA 25 mM, SDS al 0,025 % y azul de bromofenol al 0,025 %), se calentaron a 98 °C durante 5 min y se resolvieron desnaturalizando Urea-PAGE al 7,5 % (19 :1, acrilamida:bisacrilamida; National Diagnostics). La reacción se controló escaneando el gel secuencialmente con FAM seguido de la configuración de Alexa-647 usando ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad). Las intensidades del ADN cortado y no cortado se cuantificaron utilizando ImageJ 1,53 K. Los datos se ajustaron a una sola descomposición exponencial en Prism 9 (GraphPad Prism, v9.4.0) para calcular las tasas aparentes de desaminación (kapp). El corte del ADN del sustrato por D10A-Nickase del editor base, constante en todos los editores base analizados, se detectó con el fluoróforo 6-FAM y se usó como control para garantizar proteínas recombinantes uniformemente activas.

Para la cinética de rotación única de la desaminación de ssDNA independiente del ARN guía in vitro, la reacción se configuró como se describe anteriormente pero con las siguientes modificaciones: el editor base no se programó con sgRNA y se incubó con la hebra de ssDNA marcada con ATTO-647.

Para el ensayo de desaminación de punto final in vitro para comparar la desaminación por ABE 8.20, BE4, CABE-T2.17, CABE-T3.155, CBE-T1.14 y CBE-T1.52, la reacción de desaminación se configuró con 1- µM BE RNP y sustrato dsDNA 10 nM como se describe anteriormente. En lugar de puntos de tiempo, toda la reacción se inactivó después de 24 h y se precipitó como se describe anteriormente. La reacción precipitada se resuspendió en agua y se dividió en cuatro partes iguales: sin tratar, tratada con Endonucleasa V como se describe, tratada con USER II como se describe y tratada con Alquil Adenina Glicosilasa humana (hAAG; NEB 0313S) seguida de AP Endonucleasa 1 (APE1; NEB M0282L) según las instrucciones del fabricante. La combinación de hAAG y APE1 se utilizó debido a nuestra observación experimental de que G:U (producto de desaminación de citosina) es un sustrato para EndoV, lo que fue confirmado por NEB (https://www.neb.com/tools-and-resources /selection-charts/dna-repair-enzymes-on-daded-and-non-standard-bases). EndoV, por lo tanto, no se pudo usar al comparar ABE, CABE y CBE para actividades relativas de desaminación A-to-I y C-to-U. hAAG es más específico y solo produjo un producto de escisión detectable para la desaminación de A a I pero no de C a U en las mismas condiciones experimentales y, por lo tanto, se usó para tales comparaciones. Después de estos tratamientos, las muestras se resolvieron en Urea-PAGE y los datos se cuantificaron como se describe anteriormente.

Los ARNm utilizados en este estudio se produjeron a través de la transcripción in vitro de plásmidos de expresión que codifican nuestros editores y controles, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente en la ref. 13

Las células HEK293T se transfectaron a través de Lipofectamine MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific, LMRNA001) con control (Cas9, SPACE, etc.) o ARNm de codificación de editor junto con ARNg sintético (pedido especial de Axolabs) dirigido a una región en β-2-microglobulina (B2M ). La secuencia de esta guía sintética es la siguiente (sintaxis específica de Axolabs): ascsusCACGCUGGAUAGCCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGGUGCusususU

La interrupción de B2M tras la orientación exitosa de ABE, CBE o Cas9 en este sitio ha sido validada internamente. Tres días después de la transfección, las células se disociaron con TrypLE Express, se lavaron con tampón de tinción celular (Biolegend, 420201) mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón de tinción celular que contenía 1:100 de anticuerpo B2M antihumano conjugado con PE (Biolegend, 316306). Después de 30 min de incubación en hielo en la oscuridad, las células se lavaron tres veces con tampón de tinción celular mediante centrifugación y se filtraron en tubos FACS estándar de 5 ml.

Las células individuales clasificadas como negativas para PE se clasificaron en placas de 96 pocillos que contenían DMEM + FBS al 20 % + 100 unidades por ml de penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, 15140122). Para el control no tratado, las células individuales se clasificaron solo por vivas. Las estrategias de activación representativas se proporcionan en la figura complementaria 30. Después de 12 días de cultivo, se recolectó ADNg de las células utilizando el kit Agencourt DNAdvanced (Beckman-Coulter, A48705) de acuerdo con los protocolos del fabricante. La confirmación de la edición exitosa de cada clon se logró mediante la secuenciación del amplicón dirigido del amplicón B2M que abarca el sitio objetivo. Luego, la secuencia confirmada de gDNA se envió a Novogene para la preparación de la biblioteca y WGS.

Las células T humanas se aislaron de productos de leucoféresis (Leukopaks, HemaCare) mediante selección positiva utilizando CD4 y CD8 MicroBeads (Miltenyi, 130045101 y 130045201). Las células T se congelaron a 25–50 × 106 células por ml de Cryostor CS10 (Stemcell Technologies, 1001061). Para los experimentos de edición, las células T se descongelaron en un baño de agua a 37 °C y luego se dejaron reposar durante la noche en medio de expansión de células T ImmunoCult-XF que contenía (Stemcell Technologies, 10981) 5 % CTS Immune Cell SR, Glutamax, 10 mM HEPES, Penicilina/Estreptomicina al 1% (Thermo Fisher Scientific, 15140122). Al día siguiente, las células T se activaron utilizando 25 μl de activador de células T CD3/CD28/CD2 humano ImmunoCult (Stemcell Technologies, 10970) por ml de células a 1 × 106 células por ml más 300 UI ml−1 de IL-2 ( CellGenix, 1420050). Se añadió IL-2 fresca a las células T cada 2 o 3 días. Las células T se cultivaron a 37 °C y 5 % de CO2.

Las células T se transfectaron 72 h después de la activación. Las células se resuspendieron en Solución de Nucleofector de Células Primarias P3 que contenía el Suplemento 1 (Lonza, V4SP-3960). Se editaron 1 × 106 células T con 1 μg de sgRNA sintético (IDT) y 2 μg de editor mRNA en un volumen total de 20 μl utilizando el kit P3 Nucleocuvette de 96 pocillos (Lonza, V4SP-3960). Los tres sgRNA utilizados son los siguientes: B2M Exon 2 (B2M Ex.2), pmSTOP C6, CD247 pomSTOP C7 y PD-1 Ex.1 SA C7 se especifican en la Tabla complementaria 3. Las células T se sometieron a electroporación con el sistema 4D-Nucleofector. (Lonza, AAF-1003B y AAF-1003S) utilizando el programa DH-102. Todos los experimentos se realizaron con dos donantes de células T independientes. Para el análisis NGS, se sedimentaron 1 × 105 células T por condición en cada punto de tiempo, se eliminó el sobrenadante y los sedimentos se resuspendieron en 50 ml de tampón de extracción de ADN QuickExtract (Lucigen, QE09050) y se transfirieron a una placa de PCR para la secuenciación de amplicón dirigida.

La eliminación de proteínas se evaluó mediante citometría de flujo 5–6 días después de la edición. Las células T se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluoróforo para TCRα/β (Biolegend, 306718), β2M (Biolegend, 316304) y PD-1 (Biolegend, 367422) a través de una dilución 1:33 en PBS estándar. Para el análisis de PD-1 por citometría de flujo, las células T se trataron con Cell Activation Cocktail (sin brefeldina A) (Biolegend) durante la noche antes de la tinción. Los eventos se recopilaron utilizando un MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (v10.8.1)

Los hepatocitos humanos primarios congelados criogénicamente (BioIVT) se descongelaron y colocaron en placas a una densidad de 3,5 × 105 células por pocillo en placas de 24 pocillos BioCoat Collagen I (Corning, 354408) y se mantuvieron en medio CP complementado con Torpedo Antibiotic Mix (BioIVT) de acuerdo con con protocolos proporcionados por BioIVT. Una vez que se establecieron los monocultivos de PHH durante la noche, la generación de cultivos de PHH de larga duración implicó el cocultivo adicional de fibroblastos murinos 3T3-J2 (Kerafast, EF3003) a 2,0 × 104 células por pozo para los monocultivos de PHH establecidos. Los cocultivos de PHH se mantuvieron con cambios de medio cada 48 h durante la duración del estudio.

Los cocultivos de PHH se transfectaron 48 h después de la generación del cocultivo con fibroblastos murinos 3T3-J2. Las transfecciones con ARNm se realizaron utilizando Lipofectamine MessengerMax (Thermo Fisher Scientific, LMRNA003) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes, con las siguientes especificaciones optimizadas: 1 µg (para condiciones de saturación) de ARNm codificante para editor y 333 ng de ARNg sintético (Synthego) fueron combinados en 30 µl de medio reducido de suero OptiMEM (Gibco, 31985). Se añadió una mezcla de 30 µl 1:15 (Lipofectamine:OptiMEM) a la solución de mRNA/gRNA y la mezcla final resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 min. La solución completa de 60 µl se usó para tratar un pocillo de hepatocitos humanos primarios cocultivados. Cada condición de estudio se ejecutó por triplicado y las cantidades de transfección usadas se ampliaron en consecuencia. 9 días después de la transfección, los cocultivos de PHH se lisaron con una solución de Tris-HCl 10 mM pH 8,0 (Thermo Fisher Scientific, 15568025), SDS al 0,05 % (Thermo Fisher Scientific, 15553027) y 500 µg de proteinasa K (Thermo Fisher Scientific, 15568027). Scientific, EO0491) a un total de 200 µl por pocillo. Una vez lisado, el lisado se trató a 85 ° C durante 15 minutos para inactivar la proteinasa K. Las secuencias de sgRNA utilizadas en este estudio se especifican en la Tabla complementaria 3.

La cuantificación de la eliminación de la proteína PCSK9 se evaluó utilizando un kit ELISA SimpleStep de PCSK9 humano (Abcam, ab209884) midiendo la concentración de PCSK9 secretada en el sobrenadante recolectado cada 48 h. El sobrenadante se diluyó diez veces usando tampón de ensayo y el protocolo de ensayo se ejecutó de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cuantificación de LDL-R se evaluó usando un kit ELISA SimpleStep de LDL-R humano (Abcam, ab209884) midiendo la proteína LDL-R secretada en el sobrenadante recolectado cada 48 h. Ambos kits SimpleStep ELISA emplean un anticuerpo de captura marcado con etiqueta de afinidad y un anticuerpo detector conjugado indicador. El anticuerpo de captura y el anticuerpo detector se unen a los analitos de la muestra, que luego se inmovilizan en un anticuerpo antietiqueta que recubre el pozo del ensayo. Ambos ensayos ELISA colorimétricos se leen a una absorbancia de 450 nm.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación de próxima generación subyacentes a todos los experimentos se depositan en el archivo de lectura de secuencias (SRA) de NCBI bajo el proyecto de envío PRJNA869750. Las coordenadas atómicas y los factores de estructura se han depositado en el PDB como entradas: 8E2P, 8E2Q, 8E2R y 8E2S. Los datos de origen están disponibles para las Figs. 1, 3–6, Fig. de datos ampliados 5–7 y Figs. complementarias 2–4, 6, 15, 17–21, 22–29 (incluidos los archivos de origen de imágenes de gel). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Todas las herramientas de software utilizadas para el análisis de datos están disponibles públicamente y se utilizaron de la manera descrita anteriormente en la ref. 13

Komor, AC, Kim, YB, Packer, MS, Zuris, JA y Liu, DR Edición programable de una base objetivo en ADN genómico sin división de ADN de doble cadena. Naturaleza 533, 420–424 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Anzalone, AV, Koblan, LW & Liu, DR Edición del genoma con nucleasas CRISPR-Cas, editores básicos, transposasas y editores principales. Nat. Biotecnología. 38, 824–844 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Komor, AC et al. La inhibición mejorada de la reparación por escisión de base y la proteína Mu Gam del bacteriófago producen editores de base C:G-a-T:A con mayor eficiencia y pureza del producto. ciencia Adv. 3, eaao4774 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Collantes, JC et al. Desarrollo y caracterización de un sistema modular de edición de bases mediado por aptámeros de ARN y CRISPR. CRISPR J. 4, 58–68 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rees, HA, Minella, AC, Burnett, CA, Komor, AC y Gaudelli, NM Terapias de edición del genoma derivadas de CRISPR: progreso del laboratorio a la cabecera. mol. El r. 29, 3125–3139 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jin, S. et al. Los editores de base de citosina, pero no de adenina, inducen mutaciones fuera del objetivo en todo el genoma en el arroz. Ciencia 364, 292–295 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zuo, E. et al. El editor de base de citosina genera variantes sustanciales de un solo nucleótido fuera del objetivo en embriones de ratón. Ciencia 364, 289–292 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Doman, JL, Raguram, A., Newby, GA y Liu, DR Evaluación y minimización de la edición de ADN fuera del objetivo independiente de Cas9 por editores de base de citosina. Nat. Biotecnología. 38, 620–628 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, Y. et al. Editores de base de citosina con eventos fuera del objetivo de ADN y ARN no guiados minimizados y alta actividad en el objetivo. Nat. común 11 de febrero de 2052 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zuo, E. et al. Un editor de base de citosina diseñado racionalmente retiene una alta actividad en el objetivo mientras reduce los efectos fuera del objetivo tanto del ADN como del ARN. Nat. Métodos 17, 600–604 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, L. et al. Ingeniería y optimización de fusiones de desaminasas para la edición del genoma. Nat. común 7, 13330 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gaudelli, NM et al. Edición de base programable de A*T a G*C en ADN genómico sin división de ADN. Naturaleza 551, 464–471 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gaudelli, NM et al. Evolución dirigida de editores de base de adenina con mayor actividad y aplicación terapéutica. Nat. Biotecnología. 38, 892–900 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kim, HS, Jeong, YK, Hur, JK, Kim, JS y Bae, S. Los editores de bases de adenina catalizan conversiones de citosina en células humanas. Nat. Biotecnología. 37, 1145–1148 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jeong, YK et al. La ingeniería del editor de base de adenina reduce la edición de citosinas transeúntes. Nat. Biotecnología. 39, 1426–1433 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Grunewald, J. et al. Un editor base CRISPR de doble desaminasa permite la edición simultánea de adenina y citosina. Nat. Biotecnología. 38, 861–864 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhang, X. et al. El editor de base dual cataliza las conversiones de base de citosina y adenina en células humanas. Nat. Biotecnología. 38, 856–860 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sakata, RC et al. Editores de base para la introducción simultánea de mutaciones C-to-T y A-to-G. Nat. Biotecnología. 38, 865–869 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, C. et al. Mutagénesis aleatoria dirigida de genes de plantas con editores duales de base de citosina y adenina. Nat. Biotecnología. 38, 875–882 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Richter, MF et al. Evolución asistida por fagos de un editor de base de adenina con compatibilidad y actividad mejoradas del dominio Cas. Nat. Biotecnología. 38, 883–891 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsai, SQ et al. GUIDE-seq permite la creación de perfiles de todo el genoma de la escisión fuera del objetivo por nucleasas CRISPR-Cas. Nat. Biotecnología. 33, 187–197 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chaudhary, R., Garg, J., Shah, N. & Sumner, A. Inhibidores de PCSK9: una nueva era en la terapia de reducción de lípidos. Mundo J. Cardiol. 9, 76–91 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Bhatia, SN, Balis, UJ, Yarmush, ML & Toner, M. Efecto de las interacciones célula-célula en la preservación del fenotipo celular: cocultivo de hepatocitos y células no parenquimatosas. FASEB J. 13, 1883–1900 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cohen, JC, Boerwinkle, E., Mosley, TH Jr. & Hobbs, HH Variaciones de secuencia en PCSK9, LDL bajo y protección contra la enfermedad coronaria. N. ingl. J.Med. 354, 1264–1272 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rao, AS et al. El estudio de asociación de todo el fenómeno a gran escala de variantes de PCSK9 demuestra protección contra el accidente cerebrovascular isquémico. Circ. genoma Resumen. Medicina. 11, e002162 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Musunuru, K. et al. La edición de base CRISPR in vivo de PCSK9 reduce de forma duradera el colesterol en primates. Naturaleza 593, 429–434 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Benjamín, R. et al. Células T receptoras de antígeno quimérico anti-CD19 alogénicas derivadas de donantes y editadas en genoma en leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica y adulta: resultados de dos estudios de fase 1. Lanceta 396, 1885–1894 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liu, X. et al. Edición de genes multiplex mediada por CRISPR-Cas9 en células CAR-T. Resolución celular 27, 154–157 (2017).

Artículo PubMed Google Académico

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 66, 125–132 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Evans, PR & Murshudov, GN ¿Qué tan buenos son mis datos y cuál es la resolución? Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 69, 1204–1214 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCoy, AJ et al. Software cristalográfico Phaser. Aplicación J. cristalogr. 40, 658–674 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, J. et al. Caracterización estructural y cinética de Escherichia coli TadA, la tRNA desaminasa específica de oscilación. Bioquímica 45, 6407–6416 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Adams, PD et al. PHENIX: un sistema integral basado en Python para la solución de estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 66, 213–221 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG y Cowtan, K. Características y desarrollo de Focha. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 66, 486–501 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lapinaite, A. et al. Captura de ADN mediante un editor de base de adenina guiado por CRISPR-Cas9. Ciencia 369, 566–571 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Reconocemos y agradecemos a M. Humes y B. Gantzer (Beam Tx) por el soporte de automatización. Agradecemos a J. Decker y David Born (Beam Tx) por NGS y soporte computacional. Reconocemos y agradecemos a R. Manoukian y L. Hardy (Beam Tx) por su experiencia en FACS y por clasificar las células utilizadas en los experimentos WGS. Damos las gracias a A. Arvind (Beam Tx) por su ayuda con la cristalización de proteínas.

Estos autores contribuyeron igualmente: Dieter K. Lam, Patricia R. Feliciano.

Beam Therapeutics, Cambridge, MA, EE. UU.

Dieter K. Lam, Patricia R. Feliciano, Amena Arif, Tangis Bohnuud, Thomas P. Fernandez, Jason M. Gehrke, Phil Grayson, Kin D. Lee, Manuel A. Ortega, Courtney Sawyer, Noah D. Schwaegerle, Leila Peraro, Lauren Young, Seung-Joo Lee, Giuseppe Ciaramella y Nicole M. Gaudelli

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

DKL, PRF, AA y MAO realizaron experimentos dirigidos de evolución, estructurales, bioquímicos y de edición de genes y escribieron el manuscrito. CS, NS y KDL realizaron experimentos. TPF, JMG y LP realizaron experimentos con células primarias, analizaron datos y escribieron el manuscrito. TB, PG y LY analizaron los datos de secuenciación y realizaron análisis estadísticos. S.-JL dirigió el trabajo de ingeniería de proteínas, bioquímica y biología estructural y escribió el manuscrito. GC editó el manuscrito. NMG concibió y dirigió la investigación y escribió el manuscrito.

Correspondencia a Nicole M. Gaudelli.

Todos los autores eran empleados de Beam Therapeutics cuando se realizó el trabajo y son accionistas de la empresa. Beam Therapeutics ha presentado solicitudes de patentes sobre este trabajo.

Nature Biotechnology agradece a Sangsu Bae y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, El panel superior muestra la desaminación hidrolítica de adenosina catalizada por TadA. El panel inferior muestra la hidratación del análogo de adenina, 2'-desoxi-8-azanebularina (d8Az), formando el análogo de estado de transición que queda atrapado en el sitio activo al coordinarse con el zinc. b, La estructura general del homodímero funcional TadA*8.20 (cadena A en verde oscuro; cadena B en verde claro) unido a ssDNA (amarillo). c, La estructura general del monómero TadA*8.20. El monómero (verde claro) contiene cinco cadenas β (β1 a β5) y seis hélices α (α1 a α6) que se pliegan en un solo dominio con una lámina β central de cinco cadenas rodeada de hélices α. El ion zinc se muestra como una esfera gris. d, sitio activo TadA*8.20 con unión de análogo de estado de transición ssDNA-d8Az. El ion catalítico de zinc (gris) está coordinado con un residuo de histidina (H57), dos residuos de cisteína (C87 y C90) y el análogo del estado de transición d8Az (amarillo). Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas grises. e, La superficie del dímero TadA*8.20 (verde oscuro y claro) unido a ssDNA (amarillo), que muestra que ssDNA está unido en la cavidad profunda del sitio activo ubicada en la interfaz del dímero de proteína e interactúa con residuos de ambos monómeros, incluidas las sustituciones I76Y, L84F, D108N, R152P, E155V e I156F en relación con TadA de tipo salvaje. Las sustituciones en la superficie de la proteína se muestran en naranja (W23R, H36L, R51L, I76Y y A106V), en el C-terminal en rosa (S146C, D147R, R152P, Q154R, E155V, I156F y K157N) y en el sitio activo en cian (P48A, V82S, L84F y D108N). f, Interacciones entre ssDNA (amarillo) y residuos del sitio activo TadA*8.20. Los residuos de las cadenas A y B se muestran en verde claro y oscuro, respectivamente. Las sustituciones de la superficie de la proteína, C-terminal y sitio activo se muestran en naranja (cadena A), rosa (cadena B) y cian (cadena B), respectivamente. El ion zinc se muestra en una esfera gris. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas negras. En la figura complementaria 7 se muestra una vista estéreo.

Datos fuente

a, La estructura general del homodímero funcional TADAC-1.17 (cadena A en azul oscuro; cadena B en azul pizarra) con ssDNA (amarillo) unido. Las sustituciones (T17A, A48G, S82T y A142E) relativas a TadA*8.20 se muestran en esferas cian. b, La estructura general del monómero TADAC-1.17 (azul pizarra) en un complejo con ssDNA (amarillo). El monómero contiene cinco cadenas β (β1 a β5) y seis hélices α (α1 a α6) que se pliegan en un solo dominio con una lámina β central de cinco cadenas rodeada de hélices α. C y 5' representan el extremo C-terminal y el extremo 5' del ssDNA, respectivamente. c, sitio activo de TADAC-1.17 con unión de análogo de estado de transición ssDNA-d8Az. El ion de zinc catalítico (esfera gris) coordina H57, C87, C90 y el análogo de estado de transición d8Az (amarillo). La cadena lateral T82 (cian) está cerca de la cadena lateral catalítica E59 (3,9 Å; línea discontinua cian) y puede desempeñar un papel en la desaminación al donar/aceptar un protón hacia/desde E59. El residuo A17 (cian) está en la hélice α1 en la superficie de la proteína. El residuo G48 (cian) está en la hélice α2 en el bolsillo de unión del sustrato. Los enlaces H entre el análogo del estado de transición de d8Az y los residuos de proteína se muestran como líneas discontinuas grises. d, La cadena lateral del E142, ubicada en la hélice α5, se une H (línea discontinua gris) a la cadena lateral R153, ubicada en la hélice α6, y ayuda a estabilizar la hélice C-terminal α6 para colocar el lado F156 cadena para interactuar (líneas punteadas cian) con la base de pirimidina de dT(8).

a, La estructura general del homodímero funcional TADAC-1.14 (cadena A en amarillo oscuro; cadena B en amarillo claro). Las sustituciones (I49K, Y76I y G112H) relativas a TadA*8.20 se muestran en esferas magenta. El residuo H2 está desordenado y no se visualiza en la estructura. El ion zinc se muestra como una esfera gris. La línea discontinua representa el bucle parcialmente desordenado (A109 a A114) entre β4 y β5 (R107 a V130). b, La estructura general del monómero TADAC-1.14. La superposición entre las cadenas A (amarillo oscuro) y B (amarillo claro) muestra dos conformaciones diferentes para el bucle entre β4 y β5 (R107 a V130). c, sitio activo de TADAC-1.14 con agua (esfera roja) unida al ion zinc (esfera gris). Los residuos H57, C87 y C90 se coordinan con el ion zinc. La molécula de agua (esfera roja) se une con H (líneas discontinuas grises) al residuo catalítico E59. En el primer paso de la reacción TadA, esta agua se agrega al sustrato para formar una especie de estado de transición (Datos extendidos Fig. 1a). d-f, comparaciones estructurales entre las estructuras TADAC-1.14 (amarillo oscuro) sin sustrato y TadA * 8.20 unida a ssDNA (verde oscuro y amarillo). El bucle TADAC-1.14 entre β4 y β5, que contiene la sustitución G112H (magenta), tiene una conformación diferente a TadA*8.20 y puede afectar la unión de ssDNA (amarillo) al generar choques estéricos entre el residuo A109 y la base dT(8) (1,8-Å), que se encuentra junto a la base de destino d8Az(9) (d). La sustitución Y76I (magenta) puede no afectar la unión de ssDNA conservando las interacciones (líneas discontinuas negras) con la base dG(12) (e). La sustitución I49K coloca la cadena lateral K49 cerca del esqueleto dC(10) (~4,5 Å; líneas discontinuas negras) y puede contribuir a estabilizar el complejo proteína-ADN (e). La superficie de TADAC-1.14 (amarillo oscuro y claro) muestra que la nueva conformación del bucle entre β4 y β5 altera la forma de la cavidad del sitio activo en comparación con TadA*8.20 (verde oscuro y claro) (f).

a, Estructura general del homodímero funcional TADAC-1.19 (rosa oscuro y rosa claro). Las sustituciones E27G e I49N relativas a TadA*8.20 se muestran en esferas naranjas. El ion zinc se muestra como una esfera gris. b, Estructura general del monómero TADAC-1.19. C representa el extremo C. c, sitio activo de TADAC-1.19 con agua (esfera roja) unida al ion zinc. H57, C87 y C90 se coordinan con el ion zinc. La molécula de agua se une con H (líneas discontinuas) al residuo catalítico E59. d–h, comparaciones estructurales entre las estructuras TADAC-1.19 y TadA*8.20. ( d ) Superposición entre los monómeros TADAC-1.19 (rosa) sin sustrato y TadA * 8.20 unido a ssDNA (verde, amarillo), que muestran una alta similitud estructural (RMSD de ~ 0.9-Å para todos los átomos de Cα). Las principales diferencias estructurales están en la hélice α1, el bucle entre α1 y β1, y las hélices C-terminales α5 y α6. (e) TadA*8.20 tiene enlaces H de la cadena lateral E27 (líneas discontinuas negras) a las cadenas principales de A48, I49 y G50, y la sustitución de E27G elimina estas interacciones. Para compensar estos contactos críticos, TADAC1.19 coloca a E25 en una posición similar a la que antes ocupaba E27 en TadA*8.20 para hacer los mismos enlaces H (líneas discontinuas de color naranja) con A48, I49 y G50. El desplazamiento de E25 acorta la hélice α1, y el bucle entre α1 y β1 (naranja), que contiene la sustitución E27G, se extiende y se adapta a una conformación diferente en comparación con TadA*8.20 (d, f y g). Esto da como resultado el despliegue parcial de la hélice α5 para evitar el choque estérico con esta conformación de bucle y el despliegue completo de la hélice α6 (dyg). Estos cambios estructurales alteran la forma de la cavidad del sitio activo de TADAC-T1.19 (h), lo que afecta la unión del sustrato en el sitio activo (Fig. 2b). R26 presente en TADAC-T1.19-loop (naranja) haría contactos cercanos (líneas discontinuas cian) con dC(10), adyacente a la base objetivo d8Az(9), y dG(11) de TadA*8.20-ssDNA ( gramo). La sustitución de I49N coloca la cadena lateral N49 lejos del esqueleto de ssDNA (~9-Å de dG(11); líneas discontinuas cian) (f), lo que sugiere que un residuo con una cadena lateral cargada positivamente más larga como la lisina crearía contactos adicionales con el ssDNA, como se observa en la estructura TADAC-T1.14 (Datos extendidos Fig. 3e).

a, Ensayo de desaminación de punto final de 24 horas in vitro para detectar la desaminación relativa de A a I (hAAG + APE1) y C a U (USERII) por BE4, ABE8.20, CABE-Ts y CBE-Ts programado con la misma guía y actuando sobre el mismo sustrato dsDNA. Endonucleasa V, Endo V; alquil adenina ADN glicosilasa humana, hAAG; Endonucleasa 1 apurínica/apirimidínica, APE1. Las barras de error representan la desviación estándar de la media (trazada) de tres réplicas independientes. Los datos se normalizaron a la muestra no tratada. Endo V detecta la desaminación de A a I y de C a U. b, Izquierda, Tasas de rotación única de desaminación A-a-I o C-a-U del mismo sustrato dsDNA por BE RNP. Derecha, Tasas de rotación única de mellas por BE RNP en el mismo experimento que se muestra a la izquierda. Se informan las constantes de velocidad kapp de pseudo primer orden obtenidas ajustando a exponencial único (media ± sd, n = 3 réplicas independientes).

Datos fuente

a, distribución del producto de las lecturas de secuenciación asignadas como editadas para CBE-T y BE4 centrales, en las que la citosina objetivo especificada (resaltada en rojo) está mutada. Los valores se determinaron a partir de la transfección de HEK293T con ARNm en condiciones de saturación. Los valores y las barras de error reflejan la media y la DE en n = 3 réplicas biológicas independientes realizadas en días diferentes. b, Mapa de color de las conversiones máximas de C·G a T·A fuera y 5′ de la ventana de destino del protoespaciador. Se incluyen las posiciones del sitio de destino en las que se detectó una edición C-to-T >0,8 % para cualquier editor. Los valores se determinaron a partir de la transfección de HEK293T con editores o controles de codificación de ARNm en condiciones de saturación, con n = 4 réplicas biológicas independientes realizadas en días diferentes.

Datos fuente

Mapa de color del % de conversión máxima de C·G a T·A en el objetivo en sitios genómicos y % de conversión máxima de C·G a T·A en sus sitios fuera del objetivo correspondientes en células HEK293T transfectadas con el editor de codificación de ARNm (o control) más sgRNA sintético en condiciones de saturación. Los valores medianos se derivaron de n = 3 réplicas biológicas independientes realizadas en días diferentes.

Datos fuente

Figs suplementarias. 1–31, tablas complementarias 1–5, secuencias complementarias 1–31 y referencias complementarias.

Fuente de datos estadísticos para figuras complementarias. 2–4, 6, 15, 17–21 y 24–29.

Datos de fuente de imagen de gel para la figura complementaria 22.

Datos de fuente de imagen de gel para la figura complementaria 23.

Fuente de datos estadísticos, con pestañas de Excel etiquetadas con el número de figura o subfigura.

Geles sin recortar de todos los datos basados ​​en gel que se muestran (incluidos los de las figuras complementarias 22 y 23, que están invariablemente vinculados a las figuras principales y las figuras extendidas en cuestión).

Archivo de estructuras ChemDraw de Extended Data Fig. 1

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Lam, DK, Feliciano, PR, Arif, A. et al. Editores de base de citosina mejorados generados a partir de variantes de TadA. Nat Biotechnol 41, 686–697 (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01611-9

Descargar cita

Recibido: 16 Agosto 2022

Aceptado: 09 noviembre 2022

Publicado: 09 enero 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-022-01611-9

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Biotecnología de la Naturaleza (2023)