Disminución de la susceptibilidad de Plasmodium falciparum tanto a la dihidroartemisinina como a la lumefantrina en el norte de Uganda

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6353 (2022) Citar este artículo

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La resistencia parcial a la artemisinina puede facilitar la selección de Plasmodium falciparum resistente a los fármacos asociados de la terapia combinada. Evaluamos 99 aislamientos de P. falciparum recolectados en 2021 del norte de Uganda, donde han surgido mutaciones PfK13 C469Y y A675V asociadas a la resistencia, y del este de Uganda, donde estas mutaciones son poco comunes. Con el ensayo de supervivencia en anillo ex vivo, los aislamientos con la mutación 469Y (mediana de supervivencia 7,3 % para mutantes, 2,5 % mixtos y 1,4 % de tipo salvaje) y/o mutaciones en Pfcoronin o falcipain-2a, tuvieron una supervivencia significativamente mayor; todos los aislamientos con supervivencia >5% tenían mutaciones en al menos una de estas proteínas. Con ensayos de inhibición del crecimiento ex vivo, la susceptibilidad a la lumefantrina (IC50 mediana 14,6 frente a 6,9 nM, p < 0,0001) y dihidroartemisinina (2,3 frente a 1,5 nM, p = 0,003) disminuyó en el norte frente al este de Uganda; 14/49 aislamientos del norte frente a 0/38 aislamientos del este tenían lumefantrina IC50 > 20 nM (p = 0,0002). La secuenciación dirigida de 819 aislamientos de 2015–21 identificó múltiples polimorfismos asociados con sensibilidad alterada a los medicamentos, en particular PfK13 469Y con sensibilidad disminuida a lumefantrina (p = 6 × 10−8) y mutaciones de PfCRT con resistencia a la cloroquina (p = 1 × 10−20) . Nuestros resultados generan preocupación con respecto a la actividad de arteméter-lumefantrina, el antipalúdico de primera línea en Uganda.

La resistencia a los medicamentos ha desafiado el tratamiento y el control de la malaria falciparum durante décadas1. Hace unos 15 años se identificó en el sudeste asiático una resistencia parcial a las artemisininas, los fármacos más importantes que se utilizan actualmente para tratar la malaria2,3. El fenotipo de resistencia parcial implica la eliminación retardada de los parásitos después del tratamiento de pacientes con artemisininas4, o una mayor supervivencia de los parásitos cultivados después de la exposición a la dihidroartemisinina (DHA)5. Se ha demostrado que la resistencia parcial en el sureste de Asia está asociada con cualquiera de aproximadamente 20 mutaciones candidatas o validadas en el dominio de la hélice de la proteína kelch 13 (PfK13) de P. falciparum6,7. Polimorfismos adicionales han acompañado a las mutaciones de PfK13 en parásitos del sudeste asiático resistentes a la artemisinina,8,9 y la selección in vitro de parásitos africanos con DHA condujo a una eliminación tardía asociada con mutaciones en la coronina de P. falciparum (Pfcoronin)10. Las mutaciones de PfK13 validadas como mediadores de resistencia en el sureste de Asia han sido reportadas en otras partes del mundo11,12,13, pero hasta hace poco faltaba evidencia de prevalencia sostenida de estas mutaciones o resistencia clínica o in vitro documentada14. La mayor preocupación ha sido la posible aparición o propagación de la resistencia a África, donde se observa la mayor parte de la morbilidad y mortalidad por paludismo15. Recientemente, las mutaciones PfK13 previamente vinculadas a la resistencia parcial a la artemisinina en Asia se han descrito en África oriental, con la aparición de la mutación PfK13 R561H en Ruanda16,17,18 y las mutaciones C469Y y A675V en el norte de Uganda19,20,21,22. En estudios limitados, se ha demostrado que las mutaciones C469Y, R561H y A675V se asocian con la resistencia parcial a la artemisinina medida clínicamente (depuración retardada) o in vitro (supervivencia mejorada)17,22, pero nuestra comprensión de los impactos de P. falciparum recientemente surgido mutaciones en la sensibilidad a los medicamentos y la eficacia del tratamiento de las principales terapias combinadas basadas en artemisinina (ACT) en África es incompleta.

Los ACT combinan una artemisinina de acción rápida más un fármaco asociado de acción más lenta23. En el sureste de Asia, la aparición de resistencia parcial a la artemisinina fue seguida por evidencia de una disminución de la actividad antipalúdica de los medicamentos asociados de ACT, mefloquina24 y piperaquina25. En particular, la resistencia a las artemisininas, asociada principalmente con la mutación PfK13 580Y, y a la piperaquina, asociada con mutaciones novedosas en PfCRT y la amplificación del gen plasmepsina 2/3, condujo a tasas de falla para DHA-piperaquina >50 % en Camboya26,27,28. La reciente aparición de resistencia parcial a las artemisininas en el este de África puede conducir de manera similar a la selección de parásitos con menor sensibilidad a los fármacos asociados con ACT. Teniendo en cuenta el enorme número de víctimas de la malaria en África, esta consecuencia podría ser devastadora, como se vio con el surgimiento de la resistencia a la cloroquina en la década de 1980, lo que provocó un exceso de millones de muertes por malaria29.

El ACT más utilizado para tratar la malaria en África es arteméter-lumefantrina. A diferencia de la mayoría de los antipalúdicos, la lumefantrina no está disponible como monoterapia, sino que se suministra solo en combinación con arteméter. Quizás por esta razón, la resistencia de P. falciparum a la lumefantrina no se ha identificado definitivamente en parásitos aislados en el campo. Sin embargo, se seleccionó un fenotipo de resistencia inestable a la lumefantrina mediante una incubación a largo plazo con el fármaco in vitro30, y se observaron variaciones en la susceptibilidad a la lumefantrina en estudios de aislamientos de campo. La susceptibilidad a lumefantrina se ha asociado con polimorfismos en PfMDR1, un supuesto transportador de fármacos. La mutación PfMDR1 86Y fue seleccionada por el uso de amodiaquina, seleccionada en contra por la terapia con arteméter-lumefantrina, y ha disminuido a una prevalencia muy baja en la mayor parte de África15, incluida Uganda20, en los últimos años. El genotipo PfMDR1 N86 de tipo salvaje se asocia con una menor susceptibilidad a la lumefantrina ex vivo en comparación con la de los parásitos mutantes 86Y31,32, y se asoció con el fracaso del tratamiento en un análisis de datos de 31 ensayos clínicos33, pero los cambios en la susceptibilidad asociados con este alelo fueron modestos . La sensibilidad a la lumefantrina también disminuye con la amplificación del gen pfmdr134,35, pero este polimorfismo ha sido muy poco frecuente en los parásitos africanos estudiados15. En Uganda, la susceptibilidad a la lumefantrina disminuyó modestamente junto con la pérdida de la mutación PfMDR1 86Y con el tiempo31,32,36,37, la eficacia clínica relativa de arteméter-lumefantrina en comparación con la de artesunato-amodiaquina disminuyó con el tiempo38, y un ensayo reciente mostró eficacia del tratamiento de arteméter-lumefantrina por debajo del 90% en un sitio39. En general, aunque la actividad in vitro de lumefantrina y la eficacia clínica de arteméter-lumefantrina en general se han mantenido buenas, existe evidencia de que la actividad puede estar disminuyendo.

La reciente aparición de P. falciparum resistente a la artemisinina en el norte de Uganda plantea la preocupación de que pueda seguir la resistencia a los medicamentos asociados con ACT, como se ha visto en el sureste de Asia. Para explorar esta posibilidad y caracterizar mejor la resistencia parcial a la artemisinina en Uganda, comparamos genotipos y fenotipos de parásitos recolectados en el norte de Uganda, donde las mutaciones PfK13 469Y y 675V han surgido en los últimos años, y el este de Uganda, donde hemos estudiado aislamientos clínicos durante más de una década, y los marcadores de resistencia a la artemisinina han sido poco frecuentes. Además, analizamos un banco más grande de aislamientos fenotipados del este de Uganda para explorar mejor los correlatos genéticos de los fenotipos de susceptibilidad a las drogas.

Para comparar los aislamientos de diferentes partes del país, evaluamos los genotipos, la inhibición del crecimiento y la supervivencia en anillo de los aislamientos recolectados de pacientes que presentaban paludismo falciparum sin complicaciones en el Centro de Salud III de Patongo, Distrito de Agogo, en el norte de Uganda (n = 57), y Tororo District Hospital, Tororo District y Busiu Health Center IV, Mbale District, dos sitios cercanos en el este de Uganda (n = 42), del 31 de mayo al 16 de agosto de 2021 (Fig. 1). Las características de los participantes que proporcionaron estas muestras y las características de sus infecciones se describen en la Tabla 1. En una encuesta más amplia, evaluamos los genotipos y la inhibición del crecimiento para aislamientos de 819 pacientes que presentaban paludismo falciparum no complicado, incluidos los sitios mencionados anteriormente y el Hospital Masafu, Busia. Distrito, del 9 de diciembre de 2015 al 20 de agosto de 2021 (Cuadro 1). Las susceptibilidades a las drogas para las muestras del este de Uganda hasta 2019 se publicaron previamente32; en este informe nos centramos en las asociaciones entre la secuenciación en profundidad de los posibles mediadores de resistencia y los fenotipos de susceptibilidad a los fármacos.

Los sitios de estudio están etiquetados. La prevalencia combinada de las mutaciones PfK13 469Y y 675V en distritos con datos de vigilancia disponibles desde 201921 se muestra con la escala de colores. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para los aislamientos recolectados simultáneamente en el norte y el este de Uganda en 2021, utilizamos ensayos de sonda de inversión molecular (MIP) para caracterizar secuencias de 80 genes que pueden mediar la resistencia a los medicamentos (Tabla complementaria 1). De particular interés fueron los polimorfismos de parásitos recientemente asociados con sensibilidad alterada a componentes de ACT, a saber, mutaciones en el dominio de la hélice PfK13 asociadas con resistencia parcial a las artemisininas, y polimorfismos asociados con sensibilidad alterada a lumefantrina (amplificación y mutaciones de pfmdr1) y piperaquina (amplificación de plasmepsina 2/3). y nuevas mutaciones de PfCRT). De acuerdo con datos recientes, las prevalencias de las mutaciones PfK13 C469Y y A675V fueron mayores en el norte que en el este de Uganda (C469Y 34 % frente a 3 %, p < 0,001; A675V 13 % frente a 3 %, p = 0,06, Tabla 2) . Otras mutaciones del dominio de la hélice PfK13 fueron poco comunes; Se identificaron 15 mutaciones aguas arriba del dominio de la hélice. No se observaron amplificaciones de los genes pfmdr1 o plasmepsina 2/3 ni mutaciones de PfCRT asociadas con resistencia a piperaquina en Asia (T93S, H97Y, F145I, I218F, M343L, G353V)40,41. Considerando otros polimorfismos bien descritos previamente asociados con la resistencia a los medicamentos, las prevalencias de mutaciones en los transportadores PfCRT (K76T) y PfMDR1 (N86Y, D1246Y) asociadas con sensibilidad alterada a las aminoquinolinas fueron muy bajas, las prevalencias de cinco mutaciones en PfDHFR (N51I, C59R, S108N) y PfDHPS (A437G, K540E) asociados con la resistencia a los antifolatos pirimetamina y sulfadoxina fueron muy altos, y se observaron mutaciones adicionales en PfDHFR (I164L) y PfDHPS (A581G) asociadas con un alto nivel de resistencia a los antifolatos en prevalencias bajas, todas consistente con datos recientes de Uganda (Tabla 2)20,21.

Susceptibilidades a la lumefantrina (un ensayo de inhibición del crecimiento) y DHA (B RSA) en parásitos del norte y este de Uganda. Cada punto representa el resultado de un solo aislamiento (A n = 49 para el norte y 38 para el este de Uganda; B n = 52 para el norte y 29 para el este de Uganda). Los valores de p se determinaron utilizando la prueba bilateral de Mann-Whitney Wilcoxon. Los límites centrales de las cajas corresponden a la mediana, y los límites mínimo y máximo corresponden a los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden a valores extremos no más allá de 1,5 veces el IQR de los percentiles 25 o 75. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para los aislamientos de 2021 estudiados con el ensayo de supervivencia en anillo (RSA), las muestras se almacenaron a 4 °C y se transportaron el día de la recolección a nuestro laboratorio en Tororo. El tiempo de almacenamiento antes del inicio del cultivo fue ligeramente mayor para las muestras recolectadas en el norte frente al este de Uganda (mediana de 25,0 h en el norte frente a 24,0 h en el este de Uganda, p = 0,001). Se estudiaron las susceptibilidades a un panel de siete antipalúdicos con un ensayo estándar de inhibición del crecimiento (IC50) y, para DHA, con RSA ex vivo. Los ensayos de parásitos recolectados en las dos regiones del país se realizaron en forma paralela. Las susceptibilidades a la cloroquina, la desetilamodiaquina (el metabolito activo de la amodiaquina), la piperaquina, la mefloquina y la pironaridina fueron similares entre los dos sitios y, para cada uno de estos fármacos, las IC50 se encontraban en niveles generalmente considerados altamente susceptibles (Tabla 3). Por el contrario, para lumefantrina y DHA, los aislamientos del norte de Uganda fueron significativamente menos susceptibles (después de la corrección de Bonferroni) que los del este de Uganda (lumefantrina IC50 14,6 frente a 6,9 nM, p < 0,0001; dihidroartemisinina IC50 2,3 frente a 1,5 nM, p = 0,003 ; Tabla 3). Para lumefantrina, 14 de 49 aislamientos del norte, pero ninguno de los 38 del este de Uganda, tenían IC50 >20 nM (p = 0,0002; Fig. 2). Los RSA, que consistieron en contar los parásitos 72 h después del inicio de un pulso de DHA de 6 h, no mostraron diferencias significativas en la supervivencia entre los aislamientos del norte (mediana de supervivencia del 2,5 % para 52 muestras) y del este (mediana de supervivencia del 1,4 % para 29 muestras; p = 0.53) Uganda, pero cabe destacar la presencia de algunos parásitos con mutaciones PfK13 asociadas con la eliminación tardía del parásito en ambos sitios (Fig. 2).

En las 81 muestras de 2021 con datos RSA disponibles, buscamos asociaciones entre la supervivencia del anillo y los genotipos PfK13. Los aislamientos con la mutación PfK13 469Y tuvieron una supervivencia significativamente mayor, con la supervivencia más alta para los parásitos mutantes puros (mediana 7,3 %) en comparación con los parásitos mixtos (2,5 %) y de tipo salvaje puro (1,4 %) (Fig. 3). La mutación PfK13 675 V no se asoció con una mayor supervivencia, pero este análisis estuvo limitado por el tamaño de la muestra, con solo 2 aislados de 675 V mutantes puros disponibles para el estudio. Para una consideración más amplia de los determinantes de resistencia potencial, utilizamos las pruebas de Mann-Whitney Wilcoxon para buscar asociaciones entre polimorfismos en 23 genes para los cuales las variantes se han asociado con la resistencia parcial a la artemisinina y nuestros resultados de RSA (Tabla complementaria 1). Los polimorfismos poco comunes se evaluaron como variables agregadas, como se describe en Métodos. Los polimorfismos en cinco genes se asociaron con una supervivencia del anillo disminuida o aumentada en comparación con el tipo salvaje (Tabla complementaria 2). De estos genes, considerando el alelo más prevalente (alelo mayor) como tipo salvaje y el alelo menor como mutante, cualquiera de las 8 mutaciones en Pfcoronin (supervivencia 6.5% en mutante vs. 2.3% en tipo salvaje, p = 0.04) o cualquiera de 17 mutaciones en falcipaína 2a (supervivencia del 3,2 % en mutante frente al 0,6 % en tipo salvaje, p = 0,02) se asociaron más fuertemente con una mayor supervivencia en el anillo, ya sea solas o en asociación con mutaciones de PfK13 (Fig. 4). Teniendo en cuenta los impactos combinados, la presencia de PfK13 469Y más cualquier mutación en Pfcoronina (mediana de supervivencia 12,6 % en doble mutante frente a 1,4 % en doble tipo salvaje, p = 0,009) o falcipaína-2a (mediana de supervivencia 3,9 % en doble mutante frente a 0 % en doble tipo salvaje, p = 0,004) también se asoció con una mayor supervivencia. Es de destacar que, aunque algunos aislados con secuencia de PfK13 de tipo salvaje tenían altos niveles de supervivencia en el anillo, estos valores atípicos parecían explicarse por mutaciones en falcipaína-2a; todos los aislamientos con supervivencia en el anillo >5 % tenían la mutación PfK13 469Y, mutaciones en falcipaína-2a o ambas. Curiosamente, las mutaciones en PfK13 fuera del dominio de la hélice se asociaron con una menor supervivencia de RSA (lo opuesto al efecto de PfK13 469Y); considerando cualquiera de las 15 mutaciones no propulsoras identificadas, la supervivencia fue del 1,5 % en 42 mutantes frente al 5,5 % en 26 aislados de tipo completamente salvaje (p = 0,02; Tabla complementaria 2). Otros dos polimorfismos con asociaciones independientes significativas fueron la eliminación en una supuesta ubiquitina carboxilo-terminal hidrolasa 1, asociada con una mayor supervivencia de RSA, y un SNP en un gen que codifica una proteína de función desconocida, asociado con una disminución de la supervivencia.

Cada punto representa el resultado de un solo aislamiento (A n = 50 WT, 18 C469Y, 6 A675V; B n = 50 WT, 8 C469Y, 10 469Y, 4 A675V, 2 675V). Los resultados se muestran con aislados mutantes mixtos y puros combinados (A) o se muestran por separado (B). Los valores de p se determinaron utilizando la prueba bilateral de Mann-Whitney Wilcoxon. Los límites centrales de las cajas corresponden a la mediana, y los límites mínimo y máximo corresponden a los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden a valores extremos no más allá de 1,5 veces el IQR de los percentiles 25 o 75. WT, tipo salvaje. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se muestran las susceptibilidades a DHA por RSA en parásitos con diferentes genotipos de PfK13, Pfcoronin (CRN; A, B) y falcipain-2a (FP2a; C, D). Cada punto representa el resultado de un único aislado (A n = 38 WT, 18 Mut; B n = 26 C469 + CRN-WT, 9 C469 + CRN-Mut, 12 469Y + CRN-WT, 5 469Y + CRN-Mut; C n = 17 WT, 47 Mut, D n = 11 C469 + FP2a-WT, 30 C469 + FP2a-Mut, 3 469Y + FP2a -WT, 15 469Y + FP2a-Mut). Se indican los genotipos de PfK13 en el codón 469; el mutante 469Y incluye aislados mixtos. Los valores de p se determinaron utilizando la prueba bilateral de Mann-Whitney Wilcoxon. Los límites centrales de las cajas corresponden a la mediana, y los límites mínimo y máximo corresponden a los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden a valores extremos no más allá de 1,5 veces el IQR de los percentiles 25 o 75. WT, tipo salvaje, Mut, cualquier polimorfismo de pfcoronina o falcipaína 2a. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Al comparar los resultados de las muestras recolectadas del norte y el este de Uganda en 2021, los aislados con la mutación PfK13 469Y o 675 V fueron significativamente menos susceptibles a la lumefantrina (IC50 14,1 nM para 469Y mixto o mutante, 14,7 nM para 675 V mixto o mutante y 8,7 nM para el tipo salvaje; Fig. 5). Las susceptibilidades a los otros fármacos probados, incluida la mefloquina, que parece compartir algunos determinantes de la disminución de la actividad con la lumefantrina15, no difirieron entre los parásitos de tipo salvaje y los mutantes PfK13.

Cada punto representa el resultado de un solo aislado (A n = 61 WT, 17 C469Y, 6 A675V; B n = 61 WT, 7 C469Y, 10 469Y, 5 A675V, 1 675V). Los resultados se muestran con aislados mutantes mixtos y puros combinados (A) o se muestran por separado (B). Los valores de p se determinaron utilizando la prueba bilateral de Mann-Whitney Wilcoxon. Los límites centrales de las cajas corresponden a la mediana, y los límites mínimo y máximo corresponden a los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden a valores extremos no más allá de 1,5 veces el IQR de los percentiles 25 o 75. WT, tipo salvaje. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para considerar de manera más amplia las asociaciones entre fenotipos y genotipos, utilizamos un gran conjunto de 819 aislamientos con datos de inhibición del crecimiento, recolectados principalmente en el este de Uganda entre 2015 y 2021, y también incluyeron 49 muestras recolectadas en el norte de Uganda en 2021, como se describe anteriormente. El ADN del parásito se genotipificó utilizando la plataforma MIP dirigida a 80 genes que codifican proteínas potencialmente asociadas con la susceptibilidad a los medicamentos, incluidas proteínas que se sabe o se prevé que son transportadores de medicamentos y proteínas para las cuales se sabe o se sospecha que los polimorfismos contribuyen a la resistencia a los antipalúdicos establecidos y compuestos en desarrollo (Suplementario Tabla 1). Identificamos un total de 4337 polimorfismos y utilizamos las pruebas de Mann-Whitney Wilcoxon para explorar las relaciones entre la variación en los IC50 ex vivo y la presencia de estos polimorfismos.

Primero nos enfocamos en la lumefantrina, debido a la identificación de diferencias significativas en la susceptibilidad en muestras del norte y este de Uganda, como se describe anteriormente. En la evaluación de 713 aislamientos, identificamos 33 polimorfismos no sinónimos asociados con lumefantrina IC50, con significación en p ≤ 0,01. Luego filtramos para incluir solo loci donde la mediana de IC50 para alelos mixtos y mutantes tendía en la misma dirección (ambos tenían una mayor o menor sensibilidad a los fármacos en relación con los parásitos con genotipos puros de tipo salvaje) y para los cuales el alelo minoritario puro estaba presente en al menos uno. muestra. Esto resultó en la identificación de polimorfismos en 9 genes asociados con la susceptibilidad alterada a la lumefantrina (Tabla 4). En particular, las mutaciones de PfK13 que surgieron en el norte de Uganda se asociaron fuertemente con una menor susceptibilidad a la lumefantrina (469Y, p = 6 × 10−8; 675 V p = 0,001). Otras asociaciones, ya sea con aumento o disminución de la susceptibilidad a la lumefantrina, incluyeron SNP en PfMDR1, incluida la mutación 86Y que ahora es muy poco común, pero que anteriormente se asoció con una mayor susceptibilidad a la lumefantrina; y polimorfismos en una fosfolipasa putativa; el factor de transcripción ApiAP2; las proteínas de resistencia a múltiples fármacos PfMRP1 y PfMRP2; y las hemoglobinasas falcipaína-2a, falcipaína-3 y plasmepsina I (Tabla 4).

Teniendo en cuenta los otros seis fármacos probados, aplicando los mismos criterios de filtrado que para la lumefantrina, se identificaron asociaciones entre una variedad de polimorfismos y la susceptibilidad al fármaco, principalmente en niveles de significación relativamente bajos (Tablas complementarias 3–8). Lo más sorprendente fue que hubo una fuerte asociación entre mutaciones bien caracterizadas en PfCRT, incluida la mutación K76T conocida por mediar la resistencia a la cloroquina y la susceptibilidad a la cloroquina (p = 10−7−10−20 para 6 mutaciones de PfCRT) y el fármaco relacionado monodesetilamodiaquina (p = 0,01–0,0003 para 4 mutaciones de PfCRT). Estos resultados eran los esperados15 y respaldan la validez general de nuestros análisis.

Como anécdota, algunos fenotipos notables de susceptibilidad a fármacos ex vivo han demostrado ser inestables, con IC50 para fármacos antipalúdicos más bajos después de la adaptación al cultivo en comparación con los valores observados inmediatamente después de la recolección de muestras, lo que podría explicarse por un crecimiento más exitoso de cepas sensibles a fármacos en comparación con cepas resistentes a fármacos en cultivos mixtos . Para explorar la estabilidad de los fenotipos observados, cultivamos cepas adaptadas del norte de Uganda con resultados notables de lumefantrina IC50. La susceptibilidad a lumefantrina fue generalmente mayor en parásitos adaptados al cultivo en comparación con los valores iniciales ex vivo. Para ocho aislamientos con valores de CI50 de lumefantrina ex vivo original >30 nM (mediana de CI50 39,5 nM), los valores de CI50 subsiguientes medidos después del cultivo durante 4 semanas o más y luego después de congelar, descongelar, crecer en cultivo y repetir los ensayos, fueron generalmente más bajos que los valores iniciales ex vivo (Tabla 5). Sin embargo, después de la adaptación al cultivo, los valores de IC50 para estos ocho aislamientos del norte de Uganda medidos antes (mediana de IC50 13,2 nM) o después (mediana de IC50 16,9 nM evaluado en Uganda y 7,4 nM evaluado en EE. del este de Uganda para la comparación directa con los aislamientos del norte de Uganda (mediana de IC50 6,9 nM para 38 aislamientos) o para un conjunto más grande de aislamientos publicado anteriormente (mediana de IC50 5,1 nM para 365 aislamientos32).

La aparición en el norte de Uganda de P. falciparum que alberga las mutaciones PfK13 C469Y o A675V genera preocupación con respecto a la selección de parásitos resistentes tanto a las artemisininas como a los medicamentos asociados con ACT, lo que podría conducir a la incapacidad de los ACT de primera línea para tratar eficazmente la malaria. Para apreciar mejor la situación actual, comparamos directamente las susceptibilidades a los medicamentos de los aislamientos recolectados en 2021 de pacientes con malaria en el norte de Uganda, donde las mutaciones PfK13 han sido comunes en los últimos años, y el este de Uganda, donde han sido poco comunes. Encontramos, como era de esperar, una alta prevalencia de las mutaciones C469Y y A675V en aislamientos del norte de Uganda, aunque la prevalencia también fue más alta que la observada anteriormente en aislamientos del este de Uganda21. Usando el DHA RSA, la medida estándar de susceptibilidad in vitro a las artemisininas, observamos una asociación entre la mutación C469Y, pero no la mutación A675V (para la cual había pocas muestras disponibles para el estudio), y la disminución de la supervivencia del parásito. Usando ensayos estándar de inhibición del crecimiento, la susceptibilidad a la lumefantrina y el DHA, pero no a otros fármacos probados, fue significativamente menor en los aislamientos del norte, en comparación con el este de Uganda. Teniendo en cuenta una cantidad mucho mayor de aislamientos recolectados entre 2015 y 2021, pero para los cuales solo se disponía de ensayos de inhibición del crecimiento, la disminución de la susceptibilidad a la lumefantrina se asoció fuertemente con la mutación PfK13 469Y. Estos resultados sugieren que la aparición de resistencia parcial a las artemisininas se ha visto acompañada por una disminución de la actividad de la lumefantrina, lo que podría predecir la pérdida de eficacia de arteméter-lumefantrina, el antipalúdico de primera línea en Uganda y la mayor parte de África.

Es importante determinar si las mutaciones de PfK13 recientemente identificadas en el norte de Uganda19,20,21,22 están asociadas con una mayor supervivencia del parásito después de la exposición a las artemisininas. Trabajos anteriores identificaron una asociación entre la mutación 675V y el retraso en la eliminación clínica después del tratamiento con artemisininas en el sudeste asiático7. En un estudio reciente del norte de Uganda, ambas mutaciones se asociaron con un retraso en la eliminación clínica y solo la mutación 675V aumentó la supervivencia ex vivo después de la exposición al DHA, pero los análisis se vieron limitados por relativamente pocos aislamientos mutantes para el estudio22. Un estudio de Ruanda mostró que los aislamientos únicos recolectados en 2019 con las mutaciones 469 F, 561H y 675 V tenían una mayor supervivencia in vitro en comparación con un parásito de tipo salvaje18, pero hasta donde sabemos, la mutación 469Y no se había asociado previamente con una mayor supervivencia en un RSA. En nuestros estudios, la mutación 469Y se asoció significativamente con una mayor supervivencia por RSA. Por lo tanto, nuestros resultados solidifican la conclusión de que ambas mutaciones de PfK13 que surgieron recientemente en el norte de Uganda están asociadas con la resistencia parcial a la artemisinina.

Se ha demostrado que los polimorfismos en varias proteínas de P. falciparum están asociados con la resistencia parcial a la artemisinina, ya sea junto con mutaciones de PfK13 o de forma independiente8,10, pero no se han identificado mediadores consistentes distintos de PfK13, y la mediación de la resistencia parece ser altamente dependiente del fondo genético del parásito42. Nuestra evaluación de asociaciones entre polimorfismos en 23 genes candidatos y supervivencia mejorada en RSA identificó una serie de polimorfismos con asociación modesta con supervivencia mejorada (Tabla complementaria 2) y la asociación más fuerte con polimorfismos en dos genes, que codifican falcipain-2a y Pfcoronin.

Sorprendentemente, todos los aislamientos con supervivencia RSA >5 % a pesar de la falta de la mutación PfK13 469Y tenían mutaciones en falcipaína-2a. De las 17 mutaciones identificadas en la falcipaína-2a, 11 también se identificaron en aislamientos del sureste de Asia en los que los haplotipos de la falcipaína-2a se asociaron con una mayor supervivencia de RSA9. La falcipaína-2a es una hemoglobinasa que desempeña un papel clave, junto con otras proteasas, en la hidrólisis de la hemoglobina para suministrar aminoácidos para el metabolismo del parásito43. La pérdida de la actividad de la falcipaína debido al tratamiento con inhibidores específicos o la inactivación del gen redujo notablemente la actividad antipalúdica del DHA, lo que indica que se necesita la proteólisis de la hemoglobina mediada por la falcipaína para la activación eficaz de las artemisininas44. Estos resultados son consistentes con nuestra comprensión de que la conversión de artemisininas por hemo, después de la liberación de la hemoglobina, en radicales libres tóxicos, es un requisito previo para la acción eficiente de las artemisininas45. Curiosamente, se identificó una mutación que codifica un codón de terminación de falcipaína-2a en parásitos seleccionados in vitro por su resistencia a la artemisinina, pero esta selección se produjo después de la aparición de una mutación PfK136. En conjunto, los datos disponibles sugieren que ciertas mutaciones en la falcipaína-2a pueden mediar la resistencia parcial a la artemisinina independientemente de las mutaciones en PfK13 o junto con ellas.

En estudios de parásitos de Senegal, la selección in vitro de P. falciparum con concentraciones crecientes de DHA seleccionado para parásitos con mayor supervivencia asociada con mutaciones en Pfcoronin, pero no PfK1310; Los impactos de las mutaciones de pfcoronina en la supervivencia después de la exposición al DHA variaron según los antecedentes genéticos del parásito46. La pfcoronina es un miembro de la familia de proteínas de dominio de hélice WD40 que se sabe que se asocia con los filamentos de actina y las membranas intracelulares47,48. Se desconoce la base biológica de las contribuciones de las mutaciones de Pfcoronina a la resistencia parcial a la artemisinina, pero se observó que los impactos de las mutaciones de Pfcoronina están enmascarados por las mutaciones de PfK13, lo que sugiere que las mutaciones en las dos proteínas pueden afectar los mismos mecanismos del parásito46.

Polimorfismos adicionales se asociaron con supervivencia RSA alterada. Una deleción en pfubp1, que codifica una supuesta enzima deubiquitinante, se asoció con una mayor supervivencia del anillo. Dos mutaciones en el homólogo de P. chabaudi de esta proteína se asociaron con resistencia a la artemisinina en un cruce genético murino49; las mutaciones se relacionaron con la resistencia parcial a la artemisinina en P. falciparum in vitro50 y P. berghei en ratones51, pero no con la resistencia parcial clínica52; y el marcaje por afinidad mostró que la proteína se asociaba con PfK1353. Nuestros resultados respaldan estos datos limitados que identifican las mutaciones de PfUBP1 como posibles mediadores secundarios de la resistencia parcial a la artemisinina. Curiosamente, la presencia de cualquiera de las 15 mutaciones PfK13 del dominio pre-hélice se asoció con una disminución de la supervivencia. Estos resultados sugieren que, tal vez paradójicamente, estas mutaciones mejoran la actividad de la artemisinina, el efecto opuesto de las mutaciones del dominio de la hélice. Un polimorfismo en una proteína de función desconocida (Pf3D7_1433800) también se asoció con una mayor supervivencia. Se seleccionó un polimorfismo diferente en esta proteína en los mismos experimentos que identificaron a la pfcoronina como un potencial determinante de resistencia10, pero esto no pareció contribuir a aumentar la supervivencia del anillo46.

También comparamos la susceptibilidad de los aislamientos de P. falciparum a un panel de siete antipalúdicos utilizando un ensayo estándar de inhibición del crecimiento. Teniendo en cuenta solo los aislamientos recopilados y estudiados durante el mismo período en 2021, las susceptibilidades a dos fármacos, lumefantrina y DHA, fueron más bajas en los aislamientos del norte de Uganda que en los del este de Uganda. Teniendo en cuenta un conjunto mucho más grande de aislamientos recolectados en 2015–21, los polimorfismos en nueve genes se asociaron con una susceptibilidad alterada a la lumefantrina en comparación con la de los parásitos de tipo salvaje. Estos resultados destacan los posibles mediadores o factores asociados con la susceptibilidad alterada a la lumefantrina. En primer lugar, las mutaciones PfK13 469Y y 675 V se asociaron fuertemente con una menor susceptibilidad, lo que destaca la posibilidad de que la resistencia parcial a las artemisininas se asocie con una menor susceptibilidad a los fármacos asociados. Sin embargo, estos resultados no indican un papel causal de las mutaciones de PfK13 en la susceptibilidad alterada a la lumefantrina. En segundo lugar, tres mutaciones en el supuesto transportador de fármacos PfMDR1 se asociaron con una susceptibilidad alterada a la lumefantrina; uno de estos, 86Y, anteriormente tenía una alta prevalencia en África, fue seleccionado en contra por la exposición a lumefantrina15 y se asoció con una mayor susceptibilidad al fármaco en estudios anteriores31,32 y en nuestro análisis actual. En tercer lugar, las mutaciones en una supuesta fosfolipasa se asociaron con una susceptibilidad alterada a la lumefantrina. Las mutaciones en esta proteína fueron seleccionadas previamente por exposición in vitro a primaquina y se asociaron con una menor susceptibilidad a ese fármaco54. Curiosamente, las mutaciones de pérdida de función en otra fosfolipasa de P. falciparum predicha, PfPARE, se asociaron con una menor susceptibilidad a MMV011438, una serie de ésteres de pepstatina55 y el candidato antipalúdico oxoborol AN1376256, presumiblemente debido a la pérdida de la activación del fármaco intracelular. En cuarto lugar, diferentes polimorfismos en un factor de transcripción de P. falciparum predicho, ApiAP257, se asociaron con una susceptibilidad aumentada y disminuida a la lumefantrina. Diferentes mutaciones en esta proteína se asociaron con una disminución de la susceptibilidad a tres compuestos diferentes en desarrollo como antipalúdicos en un examen quimiogenético54 ya la quinina en un estudio de asociación del genoma completo58. En quinto lugar, las mutaciones en los supuestos transportadores de fármacos PfMRP1 y PfMRP2 se asociaron con alteraciones en la susceptibilidad a la lumefantrina. Otras mutaciones en PfMRP1 han sido descritas en parásitos africanos y asociadas a terapia previa con arteméter-lumefantrina59 y con disminución de la susceptibilidad a cloroquina, artemisinina, mefloquina, lumefantrina, piperaquina y/o DHA en diferentes estudios60,61,62,63. Una deleción en el promotor upstream64 de PfMRP2 y una serie de polimorfismos en la secuencia codificante65 se asociaron con una menor susceptibilidad a las aminoquinolinas. En sexto lugar, los SNP en genes que codifican hemoglobinasas, las cisteína proteasas falcipaína-2a y falcipaína-343 y la proteasa aspártica plasmepsina-I66, se asociaron con actividad alterada de lumefantrina. Como se señaló anteriormente, la disminución de la actividad de la falcipaína-2a a través de la inhibición de la enzima o la desactivación del gen provocó una disminución de la susceptibilidad a las artemisininas44, y la función alterada de otras hemoglobinasas también podría afectar la acción de la artemisinina.

La identificación de parásitos con IC50 de lumefantrina inusualmente altos del norte de Uganda generó interés en caracterizar este fenotipo. Sin embargo, el fenotipo resultó ser inestable. El crecimiento de parásitos en cultivo durante 4 o más semanas para establecer parásitos adaptados al cultivo estuvo acompañado por un aumento en la susceptibilidad a la lumefantrina. Por lo tanto, parece que algunos parásitos con sensibilidad disminuida a la lumefantrina están circulando en el norte de Uganda, pero que, en los aislamientos mixtos típicamente presentes en esta región, las cepas menos susceptibles son superadas rutinariamente por cepas más sensibles a los medicamentos durante el cultivo, y/o los fenotipos de susceptibilidad disminuida se pierden in vitro debido a diferencias ambientales inexplicables entre el crecimiento de parásitos in vivo e in vitro.

Nuestro estudio tuvo algunas limitaciones importantes. Primero, debido a los desafíos logísticos de estudiar aislamientos del distrito de Agago en nuestro laboratorio en el distrito de Tororo (~400 km de distancia), recolectamos parásitos para RSA solo durante un período de 2 meses, limitando nuestro análisis a 57 aislamientos del norte de Uganda. En segundo lugar, debido a nuestro interés en estudiar aislamientos recolectados durante el mismo intervalo de tiempo, nos limitamos al análisis de RSA para 42 aislamientos del este de Uganda. El tamaño limitado de la muestra limitó el poder de nuestros análisis RSA. En tercer lugar, los participantes que proporcionaron muestras del norte y el este de Uganda diferían en algunos aspectos, en particular una menor edad y una mayor parasitemia en los del este de Uganda; sin embargo, no se espera que estas diferencias afecten las medidas ex vivo de susceptibilidad al fármaco. En cuarto lugar, los aislamientos solían ser policlonales, como es típico en las infecciones de las regiones africanas de alta transmisión. Los IC50 ex vivo representaron necesariamente los promedios de las actividades de los clones en una muestra, y los análisis genómicos pueden haber pasado por alto algunas secuencias de clones minoritarios. En quinto lugar, nuestro enfoque de secuenciación profunda multiplex limitó el análisis de porciones de algunos genes debido a mosaicos incompletos o condiciones de PCR inadecuadamente equilibradas. Sexto, nuestros estudios se limitaron a los genes diana y no pudieron caracterizar el complemento completo de variación a lo largo del genoma en relación con la susceptibilidad a los fármacos; estudios adicionales, incluidos los estudios de asociación de todo el genoma y los cruces genéticos, serán útiles en este sentido. A pesar de estas limitaciones, creemos que las sólidas asociaciones identificadas son válidas, pero el estudio adicional de un mayor número de aislamientos recolectados en un amplio rango geográfico es sin duda una alta prioridad.

Se desconocen las ramificaciones clínicas de la disminución de la actividad de las artemisininas y la lumefantrina contra P. falciparum que circulan en el norte de Uganda. La eliminación de parásitos con mutaciones PfK13 469Y y 675 V se retrasó, en comparación con los parásitos de tipo salvaje, después del tratamiento con artesunato intravenoso22. Este resultado sugiere que las respuestas al tratamiento de la malaria grave causada por parásitos mutantes pueden ser lentas, lo que lleva a una mayor morbilidad y mortalidad graves. En Ruanda, la eliminación de parásitos con una mutación PfK13 diferente, 561H, se retrasó en comparación con la de los parásitos de tipo salvaje, después del tratamiento con arteméter-lumefantrina, pero la eficacia del tratamiento evaluada mediante medidas estándar no difirió entre los pacientes infectados con parásitos mutantes y de tipo salvaje17 . Se desconocen los impactos de las mutaciones 469Y y 675 V de Uganda en la eficacia del tratamiento con ACT. Sin embargo, las respuestas alteradas tanto a las artemisininas como a la lumefantrina, como sugieren nuestros datos, parecen afectar las respuestas a la terapia con arteméter-lumefantrina, el antipalúdico de primera línea en Uganda y la mayoría de los países endémicos de malaria en África. Los estudios en regiones con parásitos mutantes PfK13 sobre las eficacias antipalúdicas del artesunato intravenoso para tratar la malaria grave y del arteméter-lumefantrina para tratar la malaria no complicada son, por lo tanto, de máxima prioridad.

Para las evaluaciones que incluyeron RSA y ensayos de inhibición del crecimiento, se obtuvieron muestras del 31 de mayo al 17 de agosto de 2021 de 3 sitios: Patongo Health Center III, distrito de Agogo, en el norte de Uganda; Hospital del distrito de Tororo, distrito de Tororo, en el este de Uganda; y Busiu Health Center IV, Mbale District, también en el este de Uganda (Fig. 1). Para las evaluaciones que incluyeron solo ensayos de inhibición del crecimiento, se obtuvieron muestras de diciembre de 2015 a agosto de 2021 de los sitios en el este de Uganda mencionados anteriormente, así como del Hospital Masafu, distrito de Busia, también en el este de Uganda, como se describió anteriormente32. Para el Centro de Salud de Patongo, las muestras se recolectaron dos veces por semana y se transportaron el día de la recolección a nuestro laboratorio en Tororo. Las muestras de los sitios del este de Uganda se recolectaron diariamente según estaban disponibles. Se recolectaron aislamientos de pacientes de 6 meses o más que se presentaron en los sitios con síntomas clínicos de malaria, un frotis de sangre positivo para P. falciparum teñido con Giemsa y sin signos de enfermedad grave. Se excluyeron los pacientes que reportaron el uso de tratamiento antipalúdico en los 30 días anteriores o con evidencia de una infección con otras especies de Plasmodium. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Los padres o tutores de niños menores de 18 años dieron su consentimiento por escrito en su nombre; los niños de 8 a 17 años dieron su consentimiento. Se recogieron 2-5 ml de sangre venosa en un tubo de heparina antes del inicio de la terapia. A los participantes se les administró arteméter-lumefantrina, siguiendo las pautas nacionales, después de la recolección de muestras. Los estudios fueron aprobados por el Comité de Investigación y Ética de la Universidad de Makerere, el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Uganda y el Comité de Investigación Humana de la Universidad de California en San Francisco.

La parasitemia se identificó con películas delgadas teñidas con Giemsa usando un microscopio óptico con una lente objetivo de 100x y contando 1000 o más eritrocitos. Debido a consideraciones logísticas (muestras recolectadas en diferentes momentos del día y en diferentes lugares), las muestras se almacenaron a 4 °C, y el cultivo generalmente se inició la mañana siguiente a la recolección de la muestra. Los parásitos se pusieron en cultivo como se describió previamente32. La sangre se centrifugó durante 10 min a temperatura ambiente, se extrajo el plasma y la capa leucocitaria y el sedimento de eritrocitos se lavó tres veces con medio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) a 37 °C. El sedimento se resuspendió en medio completo que consistía en RPMI 1640 con HEPES 25 mM, NaHCO3 24 mM, hipoxantina 0,1 mM, gentamicina 10 μg/ml y AlbuMAX II al 0,5 % (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para producir un hematocrito. del 50%. Además, se colocaron 4 alícuotas de los gránulos lavados de aproximadamente 10 μL en papel de filtro Whatman 3MM (Cytivia, Marlborough, MA, EE. UU.) para el análisis molecular posterior.

Las susceptibilidades a los fármacos se evaluaron en muestras con un mínimo de 0,3 % de parasitemia mediante un ensayo de inhibición del crecimiento en microplaca de 72 h con detección SYBR Green, como se describió anteriormente32. Los compuestos del estudio (cloroquina, monodesetilamodiaquina, piperaquina, lumefantrina, mefloquina, dihidroartemisinina y pironaridina), suministrados por Medicines for Malaria Venture, se disolvieron en dimetilsulfóxido (excepto agua destilada para la cloroquina) como soluciones madre 10 mM y se almacenaron a -20 °C. Los fármacos se diluyeron en serie por un factor de 3 en medio completo en microplacas de 96 pocillos (50 μL por pocillo), incluidos pocillos de control libres de fármacos y parásitos, con concentraciones optimizadas para capturar curvas de dosis-respuesta completas. Los cultivos se diluyeron con eritrocitos no infectados de los bancos de sangre locales para obtener volúmenes totales de 200 μl por pocillo con una parasitemia del 0,2 % y un hematocrito del 2 %. Las placas se mantuvieron a 5 % de CO2, 5 % de O2 y 90 % de N2 durante 72 h a 37 °C en una incubadora modular humidificada (Billups Rothenberg, San Diego, CA, EE. UU.). Después de 72 h, se resuspendió el contenido de los pocillos y se transfirieron 100 μL de cultivo por pocillo a placas negras de 96 pocillos que contenían 100 μL por pocillo de tampón de lisis SYBR Green (20 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,008 % de saponina, 0,08 % de Triton X-100 , y 0,2 μL/mL SYBR Green I (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.)), y se mezclaron. Las placas se incubaron durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente y luego se midió la fluorescencia con un lector de placas FLUOstar Omega (BMG LabTech, Cary, NC, EE. UU.; excitación de 485 nm y emisión de 530 nm). Para monitorear la estabilidad de las reservas de fármacos, se mantuvieron en cultivo y se analizaron (comenzando en la etapa de anillo) aproximadamente las cepas de control de laboratorio P. falciparum Dd2 (MRA-156) y 3D7 (MRA-102) (BEI Resources, Manassas, VA, EE. UU.) mensualmente, previa sincronización con una columna magnética (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EE. UU.). Para la adaptación de los parásitos para el cultivo a largo plazo, los aislados recién recolectados se diluyeron al 1 % de parasitemia, si era necesario, usando eritrocitos de donantes y se cultivaron con un hematocrito del 2 % en medio RPMI completo en las condiciones descritas anteriormente. Los cultivos se diluyeron con eritrocitos no infectados según fuera necesario. Después de ~ 4 semanas, los parásitos en etapa de anillo se crioconservaron en una solución de Glycerolyte-57 (Frensenius Kabi AG, Hamburgo, Alemania) y se almacenaron en nitrógeno líquido en fase gaseosa.

Los ensayos estándar de inhibición del crecimiento no predicen la eliminación clínica retrasada asociada con parásitos resistentes a la artemisinina. Por lo tanto, la susceptibilidad al DHA se midió utilizando el RSA ex vivo, como se describió previamente67. En resumen, parásitos recién cultivados con un mínimo de 0,2 % de parasitemia, preparados como se describe anteriormente para ensayos de inhibición del crecimiento, se incubaron con DHA 700 nM o, para controles, DMSO al 0,1 %, durante 6 h. Los aislamientos con >1 % de parasitemia se diluyeron al 1 %; los aislamientos con ≤1% de parasitemia se cultivaron al inicio de las parasitemias. Las células se lavaron para eliminar el fármaco después de 6 horas y el cultivo continuó durante 66 horas más. A las 72 h después del inicio del cultivo, se prepararon frotis delgados teñidos con Giemsa. Los cultivos se consideraron viables y apropiados para la evaluación si la parasitemia de control era ≥0,2 % y también ≥25 % de la parasitemia inicial. Se contaron las parasitemias en los cultivos de control y tratados, y la supervivencia de RSA se expresó como la proporción de parásitos viables en los cultivos tratados con DHA en relación con los controles.

Las secuencias de genes y el número de copias se analizaron mediante captura MIP y secuenciación profunda, como se describió anteriormente21,32,68. Para la captura de MIP, nos dirigimos a un total de 80 genes, seleccionados debido a roles conocidos o potenciales en la susceptibilidad alterada a los antipalúdicos estándar o compuestos en desarrollo (Tabla complementaria 1), utilizando sondas publicadas previamente y recientemente diseñadas (Tabla complementaria 9). Se diseñaron nuevas sondas utilizando el software MIPTools (versión 0.19.12.13). El ADN se aisló con tampón de extracción Chelex-100 como se informó anteriormente, utilizando Tween 20 al 0,01 % en lugar de saponina21. La captura de MIP, la preparación de la biblioteca y la secuenciación se realizaron como se describió anteriormente68. Las lecturas de secuenciación están disponibles en el archivo de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (número de acceso PRJNA850445). Se utilizó MIPTools para organizar los datos de secuenciación sin procesar y para realizar llamadas de variantes. Se asignaron genotipos individuales para sitios polimórficos que estaban cubiertos por un mínimo de 10 identificadores moleculares únicos (UMI) y se requería que las variantes tuvieran un recuento de alelos dentro de la muestra ≥3 UMI para alelos alternativos y ≥2 UMI para alelos de referencia. El número de copias se estimó sobre la base de la muestra y la sonda de profundidad normalizada de la cobertura de secuencia de 31 sondas únicas para pfmdr1 y 21 sondas para plasmepsina 2/3. La cepa Dd2, que contiene pfmdr1 amplificado y es una copia única de plasmepsina 2/3, y el subclón G8 de KH001_053 (amablemente proporcionado por Selina Bopp y la colaboración TRAC), que tiene múltiples copias de plasmepsina 269, se usaron como controles. La complejidad de la infección (COI) se estimó a partir de los datos de genotipificación generados por la secuenciación MIP utilizando THE REAL McCOIL, un modelo Monte Carlo de cadena de Markov que estima la frecuencia alélica y el COI de las muestras70.

Los valores de IC50 se derivaron mediante el trazado de la intensidad de fluorescencia frente a la concentración logarítmica del fármaco y se ajustaron a una curva no lineal utilizando una ecuación de Hill de cuatro parámetros en Prism (versión 9.0), como se describió anteriormente32. Todos los análisis adicionales se realizaron en R (versión 4.1.2). Los datos categóricos se evaluaron mediante pruebas exactas de Fisher de dos caras y datos continuos, incluidos ensayos de inhibición del crecimiento y RSA, con pruebas de Mann-Whitney Wilcoxon de dos caras. Para la evaluación de los datos de IC50, los genotipos se consideraron como variables binarias, determinadas por la presencia o ausencia del alelo menor (se combinaron genotipos de alelos menores puros y mixtos). P ≤ 0,01 se consideraron significativos. Para la supervivencia de RSA, los loci con alta (>15%) prevalencia de alelos menores se evaluaron de forma independiente, como se describió anteriormente, y los loci con baja (≤15%) prevalencia de alelos menores se analizaron como variables agregadas, en las que la presencia de cualquier alelo menor se comparó con el alelo mayoritario. Tanto para los loci de alta como para los de baja prevalencia, p ≤ 0,05 se consideraron significativos. Para los loci que fueron estadísticamente significativos, la supervivencia de RSA también se evaluó en el contexto de las mutaciones K13 C469Y y A675V. Los loci candidatos y los genotipos K13 se trataron como variables binarias como se describe anteriormente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos relevantes están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud. Los datos de secuencia están disponibles en el archivo de lectura de secuencia del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (número de acceso PRJNA850445). Los datos y el código están disponibles en https://github.com/PJRosenthalLab/2022_Tumwebaze_NatCom. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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El estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (AI075045 (PJR), AI089674 (PJR), TW007375 (PJR) y AI139520 (JAB)) y Medicines for Malaria Venture (RD/15/0001 (PJR)). Agradecemos a los participantes del estudio y al personal de las clínicas donde se recogieron las muestras. Agradecemos a Selina Bopp, Sarah Volkman y los miembros de la colaboración TRAC por proporcionar amablemente un clon KH001_053 como control del número de copias.

Estos autores contribuyeron igualmente: Patrick K. Tumwebaze, Melissa D. Conrad.

Colaboración para la Investigación de Enfermedades Infecciosas, Kampala, Uganda

Patrick K. Tumwebaze, Stephen Okitwi, Stephen Orena, Oswald Byaruhanga, Thomas Katairo y Samuel L. Nsobya

Universidad de California, San Francisco, CA, EE. UU.

Melissa D. Conrad, Jennifer Legac, Shreeya Garg y Philip J. Rosenthal

Universidad de Brown, Providence, Rhode Island, EE. UU.

David Giesbrecht, Sawyer R. Smith y Jeffrey A. Bailey

Universidad Dominicana de California, San Rafael, CA, EE. UU.

Frida G. Ceja & Roland A. Cooper

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Todos los autores concibieron y diseñaron los experimentos; PKT, MDC, MO, SO, OB, TK, JL, SG, DG, SRS, FGC y RAC adquirieron los datos; PKT, MDC, MO, SO, TK, SG, DG, JAB, RAC y PJR analizaron e interpretaron los datos; PKT, MDC, SLN, JAB, RAC y PJR jugaron papeles principales en la redacción del manuscrito. Todos los autores aprovaron el manuscrito final.

Correspondencia a Melissa D. Conrad o Philip J. Rosenthal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Colin Sutherland, Didier Menard, Dulcie Lautu-Gumal y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Gracias, PK, Conrad, MD, Okitwi, M et al. Disminución de la susceptibilidad de Plasmodium falciparum tanto a la dihidroartemisinina como a la lumefantrina en el norte de Uganda. Nat Comun 13, 6353 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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Recibido: 23 junio 2022

Aceptado: 06 de octubre de 2022

Publicado: 26 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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