Flavina

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4896 (2022) Citar este artículo

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Las reacciones de apertura del anillo de epóxido son comunes e importantes tanto en procesos biológicos como en aplicaciones sintéticas y pueden ser catalizadas de manera no redox por epóxido hidrolasas o reductivamente por oxidorreductasas. Aquí informamos que las fluostatinas (FST), una familia de anguiciclinas atípicas con un núcleo de benzofluoreno, pueden sufrir reacciones de apertura del anillo epóxido no catalizadas por enzimas en presencia de dinucleótido de flavina y adenina (FAD) y dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH). Se muestra que el anillo de 2,3-epóxido en FST C se abre de manera reductora a través de un intermediario enol putativo, o de manera oxidativa a través de un intermediario peroxilado con oxígeno molecular como oxidante. Estas reacciones conducen a múltiples productos con diferentes estados redox que poseen un solo grupo hidroxilo en C-2, un 2,3-diol vecinal, un anillo A de cinco miembros contraído o un anillo A de siete miembros expandido. También tienen lugar reacciones similares tanto en productos naturales como en otros compuestos orgánicos que albergan un epóxido adyacente a un grupo carbonilo que está conjugado con un resto aromático. Nuestros hallazgos amplían el repertorio de la química de flavina conocida que puede proporcionar herramientas nuevas y útiles para la síntesis orgánica.

Los epóxidos son bloques de construcción importantes en la síntesis orgánica y la biosíntesis1,2. Debido a la tensión significativa del anillo de oxirano de tres miembros y los enlaces oxígeno-carbono polarizados, los epóxidos pueden experimentar fácilmente una apertura de anillo regioselectiva y estereoselectiva bajo el control de un catalizador apropiado3,4. La apertura del anillo epóxido generalmente se produce mediante la adición nucleófila con inversión de la estereoquímica; sin embargo, la regioselectividad puede ser sensible a si la reacción se lleva a cabo en condiciones ácidas o alcalinas, como se muestra en la Fig. 1a5. En consecuencia, se han desarrollado varios nucleófilos para reaccionar con epóxidos a fin de producir sistemas difuncionalizados en 1,2 con estereoquímica trans6. La apertura del anillo de epóxido también puede ser catalizada por enzimas como las epóxido hidrolasas (EH) o las oxidorreductasas (OR) (Fig. 1b)7. Los EH catalizan la hidrólisis de epóxidos a dioles transvicinales8,9; Los OR catalizan la reducción estereoselectiva de un epóxido a un alcohol (Fig. 1b)10,11.

a Reacciones de apertura de anillo de epóxido no enzimático que implican la adición de un nucleófilo (Nuc) en condiciones básicas o ácidas. b Reacciones enzimáticas de apertura de anillo de epóxido por epóxido hidrolasas (EH) y oxidorreductasas (OR). c Reacciones de apertura de anillo de epóxido de fluostatina C (1), ya sea catalizadas enzimáticamente por la hidrolasa Alp1U, o mediadas no enzimáticamente por FAD y NADH, como se informó en este estudio.

Los epóxidos también son un elemento estructural importante que se encuentra en una amplia variedad de productos naturales e intermedios reactivos en las rutas biosintéticas1. En particular, las fluostatinas (FST, p. ej. 1)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, las kinamicinas23, las lomaiviticinas24,25 y las nenestatinas26,27,28 constituyen una familia de fármacos atípicos. anguciclinas con un núcleo de benzofluoreno (Fig. 1 complementaria). El núcleo de benzofluoreno de las kinamicinas y lomaiviticinas está además decorado con un grupo diazo que dota a estos compuestos de potentes actividades antitumorales que han atraído una atención considerable29,30. Las anguiciclinas atípicas a menudo se caracterizan por un anillo A altamente oxigenado que puede sufrir modificaciones adicionales, como acilación, epoxidación, glicosilación y dimerización, lo que conduce a una diversidad estructural significativa18,21,27,31,32. Recientemente se informó que las α/β hidroxilasas Alp1U y Lom6 catalizan reacciones de hidrólisis de epóxido estereoselectivas durante la biosíntesis de kinamicinas y lomaiviticin23. También se ha demostrado que Alp1U hidroliza el epóxido de FST C (1) para producir las dos FST estereoisoméricas C1 (2) y C2 (3) (Fig. 1c)18,33.

Se ha demostrado que la α/β-hidrolasa FlsH de la vía FST en Micromonospora rosaria SCSIO N160 derivada del mar de China Meridional cataliza la desacilación de acil FST;18 sin embargo, es incapaz de catalizar la hidrólisis del epóxido en FST a pesar de su homología con Alp1U18. Se ha propuesto que las FST aisladas de forma natural (Fig. 1 complementaria), como FST B12, pirazolofluostatinas A‒C16 y FST R17, deriven de los correspondientes precursores de epóxido; sin embargo, dada la actividad de FlsH, no está del todo claro cómo se escindiría el epóxido y qué enzimas, si las hubiera, serían las responsables.

En este trabajo, se muestra que el anillo de 2,3-epóxido en FST C (1) se abre de forma no enzimática en presencia de dinucleótido de flavina y adenina (FAD, 4) y dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADH) con FADH2 reducido (5) o C4a- hidroperoxiflavina (FADOOH, 6) que actúa como especie reactiva de flavina (Fig. 1c). Las reacciones de apertura del anillo del epóxido pueden así proceder de manera reductora para generar un intermediario enol putativo, que se tautomeriza a productos que poseen un solo grupo hidroxilo en C-2 (7 y 8), o se modifica adicionalmente por 6 a productos con un diol vecinal en C-2 y C-3 (3 y 9). En presencia de oxígeno molecular, las reacciones de apertura del anillo del epóxido también pueden desarrollarse de manera oxidativa y dar lugar a un intermedio peroxilado, que puede reducirse aún más mediante el NADH a 3 y 9, o puede sufrir reordenamientos del anillo para producir productos con una fracción de cinco contraídos. anillo en A de miembros (10) o un anillo en A de siete miembros puenteado y expandido (11). Como resultado, esta reacción de escisión de epóxido no enzimática puede explicar la formación de varios derivados de FST diferentes observados en la naturaleza. Experimentos adicionales muestran que también tienen lugar reacciones similares tanto en productos naturales como en otros compuestos orgánicos que albergan un epóxido adyacente a un grupo carbonilo que está conjugado con un resto aromático. Por lo tanto, esta reacción de apertura de anillo no catalizada por enzimas promete ser una herramienta útil en la síntesis orgánica.

Se demostró previamente que la α/β hidroxilasa Alp1U hidroliza el epóxido de FST C (1) para producir FST C1 (2) y FST C2 (3) (Fig. 2a, trazas i-ii)18,33. Por el contrario, el homólogo de Alp1U, FlsH, no puede catalizar la hidrólisis del anillo de epóxido en 1 (Fig. 2a, traza iii)18. Una posible explicación es que FlsH podría requerir una proteína asociada o un cofactor exógeno para catalizar la hidrólisis del epóxido. Con el fin de probar estas hipótesis, se seleccionaron varias flavina reductasas, incluida Fre de E. coli34, para examinar su competencia como proteínas asociadas putativas para FlsH. Se encontró que la incubación de FST C (1) con FlsH y Fre en presencia de NADH dio lugar a múltiples productos (Fig. 2a, traza vi). Sin embargo, experimentos adicionales mostraron que también se observó la formación del mismo conjunto de productos en ausencia de FlsH (Fig. 2a, traza vii), lo que sugiere que Fre solo pudo mediar la misma descomposición de FST C (1). Además, la incubación de 1 con varias otras flavoenzimas, incluidas FlsO2 (prejadomicina oxidasa)35, TiaM (tiacumicina halogenasa)36,37 y XiaK (xiamicina N-hidroxilasa)38 también condujo al mismo resultado (Fig. 2 complementaria). Dado que todas las actividades de estas flavoenzimas dependen de la reducción de FAD por NADH, se propuso que la flavina reducida por sí sola sirviera como catalizador real del consumo de FST C (1). De hecho, se observaron productos similares tras la incubación de FST C (1) con FAD y NADH en ausencia de enzimas, de modo que FAD y NADH son suficientes (Fig. 2a, trazas viii y xii) y necesarios (Fig. 2a, trazas ix‒xi) para facilitar la descomposición no enzimática de FST C (1).

un análisis HPLC de reacciones que implican FST C (1). (i) 1 estándar; (ii) 1 + Alp1U; (iii) 1 + FlsH; (iv) 1 + FlsH + Fre; (v) 1 + FlsH + NADH; (vi) 1 + FlsH + Fre + NADH; (vii) 1 + Fre + NADH; (viii) 1 + FAD + NADH; (ix) 1 + Fre; (x) 1 + NADH; (xi) 1 + DAP; (xii) 1 + FAD + NADH. La HPLC se realizó utilizando una columna C18 de fase inversa (i-xi) o en una columna polar (xii). Las reacciones se llevaron a cabo durante 30 min a 30 °C en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) que contenía enzima(s) 5 μM (Alp1U, FlsH o Fre), FAD 100 μM y NADH 10 mM. b Las estructuras cristalinas de rayos X de 7 y 10. c Espectro ECD experimental de 9 (línea negra) comparado con el espectro B3LYP/TZVP PCM/MeCN // ωB97X/TZVP PCM/MeCN de (1R,2S,3R)-9 (línea roja). Las barras representan valores de resistencia rotacional para los conformadores de solución de energía más baja.

Los productos de reacción (3 y 7-11) se aislaron de una reacción a mayor escala de FST C (1) con FAD y NADH y se caracterizaron estructuralmente como se muestra en la Fig. 1c. Se identificó que el primer producto era FST C2 (3) (Figura 3 y Tabla 1 complementarias), que también es un producto de la reacción de hidrólisis catalizada por Alp1U33. Se estableció que el segundo producto de reacción 7 (Figura 4 y Tabla 2 complementarias) tenía la misma estructura plana que la FST B, una FST aislada naturalmente de Streptomyces sp. TA-339112 y Streptomyces cepa Acta 1383;13 sin embargo, no se determinó la configuración absoluta de FST B12. La configuración absoluta (1R, 2R, 3S) de 7 se estableció mediante la metodología de solución TDDFT-ECD (Figura 5 complementaria) y se confirmó mediante análisis de rayos X de cristal único (Figura 2b, CCDC 2036399; Tabla complementaria 3). Se determinó que el tercer producto 8 (Fig. 6 complementaria y Tabla 2) tenía la misma estructura plana que 7 y se asignó la configuración absoluta (1R, 2R, 3R) de 8 mediante la comparación de los espectros ECD experimentales y calculados realizados en el estereoisómero (1R, 2R, 3R) (Fig. 7 complementaria)39. Para distinguir los dos estereoisómeros de FST B, 7 y 8 se denominaron FST B1 y FST B2 (Fig. 1), respectivamente. El producto 9 (designado FST C3, Fig. 1) se aisló con el mismo tiempo de retención que el 3 durante el análisis HPLC con una columna C18 de fase inversa. El análisis del ensayo usando una columna de HPLC polar permitió la separación de estas dos especies (Fig. 2a, trazo xii). Finalmente, 9 fue identificado como un estereoisómero de 3 por HRESIMS y datos de RMN (Fig. 8 y Tabla 4 complementarias), y la configuración absoluta (1R, 2S, 3S) de 9 se estableció mediante la metodología TDDFT-ECD (Fig. 2c , Figura complementaria 9).

También se identificaron y caracterizaron estructuralmente dos productos adicionales 10 y 11 (Fig. 1c; Fig. 2a, trazas vi-viii y xii). Se descubrió que el producto 10, designado FST C4 (Fig. 1), poseía un anillo A de cinco miembros contraído mediante análisis espectroscópico de RMN (Fig. 10 complementaria y Tabla 5) y se determinó que tenía el (1R, 2R) absoluto configuración mediante análisis de rayos X de cristal único (Fig. 2b; Tabla complementaria 6; CCDC 2129081). El producto 11, denominado FST C5 (Fig. 1), se elucidó estructuralmente para tener un anillo A de siete miembros con puente y expandido (Fig. 11 complementaria y Tabla 5). La asignación de la configuración absoluta (1R,2R,3R) a 11 se basó en su origen de 1, pero por lo demás sigue siendo tentativa, porque no fue posible una caracterización experimental definitiva debido a su inestabilidad. Actualmente, no hay informes de que el 11-S haya sido aislado de una fuente natural.

Para investigar el mecanismo de la reacción no enzimática de apertura del anillo de epóxido, se coincubaron FST C (1), FAD y NADH en tampón PBS (pH 7,0) preparado con óxido de deuterio (2H2O). La incorporación de un solo deuterón tanto en 7 como en 8 se indicó por la presencia de un pico de iones moleculares desplazados + 1 Da en m/z 326,7 ([M ‒ H] ‒) para ambos productos reducidos (Fig. 12 complementaria). Por el contrario, no se observaron cambios en los pesos moleculares de 3, 9, 10 u 11 (Fig. 12 complementaria). Posteriormente, 7-2H y 8-2H se aislaron de reacciones escaladas y se analizaron mediante 1H y 13C NMR (Figuras complementarias 13, 14 y Tabla 2). La comparación de los espectros de RMN 1H de 7-2H y 7 reveló que la señal del protón 3-H de 7 había desaparecido en 7-2H y mientras tanto el doblete 3-Me de 7 se había colapsado en un singlete en 7-2H (Fig. 3a ), que ubicó 2H en C-3 de 7-2H. En apoyo de esta asignación, la correlación COSY entre los protones H-2 y H-3 observados en 7 estuvo ausente en 7-2H (Figuras complementarias 4, 13). Del mismo modo, también se observó un singlete para el 3-Me junto con la ausencia de cualquier correlación COSY entre H-2 y H-3 en 8-2H (Fig. 3a; Figs. Suplementarias 13, 14). Además, los espectros de RMN de 13C de 7-2H y 8-2H mostraron un ensanchamiento y una intensidad reducida de las señales de C-3, y también se observaron acoplamientos de 2H‒13C en C-3 (Figuras complementarias 13, 14)40. Estas observaciones demuestran que se incorpora un solo hidron solvente en C-3 durante la reducción de 1 a 7 y 8.

un análisis de RMN de la incorporación de 2H o 18O en productos e intermedios, así como posibles interconversiones. La incorporación de deuterio de 2H2O en C-3 de 7 y 8 se infirió a partir del análisis espectroscópico de 1H NMR. El marcaje con O18 en 3-18O y 9-18O fue respaldado por análisis HRMS. Se muestran las estructuras asignadas de 12 y 14, mientras que la estructura propuesta de 13 sigue siendo especulativa debido a su escasa estabilidad. b Análisis HPLC de reacciones en condiciones variables. (i) 1 estándar; (ii) 1 + FAD + NADH (en el aire); (iii) 1 + FAD + NADH (menos de 18O2); (iv) 1 + FAD + NADH (bajo N2); (v) 7 en tampón de bórax/NaOH 50 mM (pH 10) a 30 °C durante 12 h; (vi) 1 100 μM + FAD 10 μM + NADH 2 mM (30 °C durante 30 min); (vii-ix) incubación de 13 recogidos de (vi) con (vii) H2O; (viii) DAP; (ix) FAD + NADH; las reacciones de (viii) y (ix) se realizaron en O2 a 30 °C durante 30 min en tampón PBS 50 mM (pH 7,0); (x) 14 en H2O; (xi) 14 + FAD; (xii) 14 + NADH; (xiii) 14 + FAD + NADH. Las reacciones de (x-xiii) se realizaron a 30 °C durante 30 min. Las reacciones de (xiv‒xvii) involucraron la incubación de 1 y NADH con diferentes cofactores de flavina: (xiv) FAD; (xv) FMN; (xvi) riboflavina; (xvii) isoaloxazina a 30 °C durante 30 min. (xviii) La reacción que contenía 1, F420, glucosa 6-fosfato y FGD se incubó a 30 °C durante 10 h. El análisis de HPLC se realizó con detección UV a 304 nm utilizando una columna polar (trazas iv y x-xviii) o una columna C18 de fase inversa (trazas vi-ix).

Cuando FST C (1) se incubó con NADH y FAD bajo 18O2 (Fig. 3b, trazas i-iii), el análisis LC-MS de los productos de reacción reveló un aumento de +2 Da en la masa molecular de los productos oxidados, lo que produjo 3 -18O, 9-18O, 10-18O y 11-18O (Fig. 3a; Fig. 15 complementaria). Estos datos indican que la conversión de 1 a 3, 9, 10 y 11 implica la incorporación de un átomo de oxígeno del O2. Además, la producción relativa de 3/9 y 10/11 versus 7/8 fue dependiente de O2, porque la incubación de FST C (1) con FAD y NADH después de saturar el tampón de reacción con O2 condujo a un aumento significativo en los niveles de la el primero (3, 9-11) versus el segundo (7 y 8); por el contrario, saturar el tampón de reacción con N2 condujo a 7 y 8 como productos dominantes (Fig. 3b, trazas iii y iv). Para ubicar la posición exacta de incorporación de 18O durante la reacción (1 → 3/9), se realizó una reacción a mayor escala incubando 1, FAD y NADH en tampón PBS saturado con 18O2 (pH 7,0). Se aislaron dos productos 3-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343,0718) y 9-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343,0722) (Fig. 3a; Fig. 16 complementaria). El análisis de RMN mostró que la etiqueta 18O se incorporó en C-3 de 9-18O (Fig. 17 complementaria). Específicamente, la comparación de los datos de 13C NMR para 9 y su isotopólogo 18O 9-18O demostró un cambio de campo ascendente de 3.8 Hz de δC-3 en este último en relación con el de 9 (Figura complementaria 18 y Tabla 4), lo que respalda la etiqueta 18O en C-3 (es decir, 9-18O)41,42.

Posteriormente, se investigó la dependencia del pH de la descomposición dependiente de FAD/NADH de 1 realizando la reacción en tampones en el rango de pH de 3 a 10. Después de la incubación de 1 100 μM con FAD 100 μM y NADH 10 mM durante 2 h a 30 °C, 1 se convirtió de manera más eficiente en los productos de anillo abierto de epóxido con tampones en el rango de pH de 5 a 7; sin embargo, la reacción fue menos eficiente en condiciones más alcalinas a pH 9–10 (Fig. 19 complementaria). FST B1 (7) fue bastante estable a pH 3–7; sin embargo, se convirtió fácilmente a 8 a un pH más alto (Fig. 20 complementaria), donde también se oxidó para producir el producto natural FST A (12) informado anteriormente (Fig. 3b, traza v; Fig. 20 complementaria y Tabla 1) 12 FST B2 (8) también fue estable a pH 3–6, y se convirtió fácilmente a 7 y 12 en tampones más alcalinos (Fig. 20 complementaria). Por el contrario, FST C (1) fue muy estable a pH 3-10, incluso en presencia de FAD o NADH solos (Fig. 21 complementaria), lo que nuevamente demuestra que la descomposición del epóxido en 1 requiere la presencia tanto de FAD como de NADH.

Un análisis del curso del tiempo de 100 μM 1 con 100 μM FAD y 10 mM NADH demostró la formación transitoria de una especie intermediaria 13 que desapareció después de una incubación más prolongada (Fig. 22 complementaria). También se incubó una concentración inicial fija de 1 (100 μM) con concentraciones variables de FAD (1, 10 y 100 μM) y NADH (2, 5 y 10 mM) durante 30 min a 30 °C (Fig. 22 complementaria). ). La vida útil del intermedio transitorio se extendió significativamente a niveles reducidos de FAD (Fig. 3b, traza vi). Esto permitió la recogida del intermedio 13 seguido de una reinyección inmediata en HPLC demostrando su conversión a 7 y 12 (Fig. 3b, trazo vii). Cuando el intermedio aislado 13 se incubó inmediatamente con FAD bajo O2, se observó de nuevo la producción de 7 y 12 (Fig. 3b, traza viii); sin embargo, si también se incluyó NADH en la incubación, entonces se observó 3 como producto principal con 12 como producto secundario, y ya no se observó 7 (Fig. 3b, trazo ix). El espectro de absorbancia UV del intermedio 13 fue muy similar a los de 1, 3 y 7, y el análisis LC-MS del intermedio indicó una m/z 325,7 para el ion [M–H]– (Figura complementaria 23) . Con base en estas mediciones, se propone tentativamente que el intermedio sea el enol 13 (Fig. 3b), que es esencialmente un tautómero de 7 y 8 y, por lo tanto, tiene el mismo estado de oxidación que estos dos productos.

Si bien se hicieron varios intentos para aislar el intermedio para confirmar su asignación estructural como 13, solo se obtuvo 7 como producto principal junto con otro compuesto secundario 14. Esto es consistente con la poca estabilidad del intermedio y su fácil conversión a 7. (Fig. 3b, traza vii, Fig. 24 complementaria). Sin embargo, 14 pudo caracterizarse y, por lo tanto, se identificó como el peróxido C-3 denominado hidroperoxifluostatina (Fig. 3a; Fig. 25 complementaria y Tabla 5); sin embargo, la mala recuperación de 14 impidió la recopilación de suficientes espectros para una caracterización completa de su configuración absoluta en C-3. La hidroperoxifluostatina (14) fue estable en agua, incluso en presencia de FAD (Fig. 3b, trazas x y xi). Si bien la coincubación de 14 con NADH solo condujo a múltiples productos 3, 9, 10 y 11, la inclusión de FAD con NADH no cambió el perfil del producto (Fig. 3b, trazas xii y xiii; Fig. 26 complementaria). Dada la conversión observada de 14 en 3 y 9, el compuesto 14 es probablemente una mezcla de los estereoisómeros (1S,2S,3R) y (1S,2S,3S). El hecho de que el aislamiento de 13 proporcionara una cantidad menor de 14 sugiere que 14 es otro intermedio que coeluye con 13 en lugar de derivar de 13. Además, mientras que 3/9 podrían generarse a partir de 13 y 14, 7/8 solo fueron producido a partir de 13, mientras que 10/11 se derivaron exclusivamente de 14 (Fig. 3a).

Cuando se consideraron otros cofactores relacionados con la flavina, también se encontró que FMN y riboflavina en lugar de FAD mediaban de manera eficiente la descomposición de 1 en presencia de NADH (Fig. 3b, trazas xiv-xvi). La isoaloxazina y el NADH también pudieron facilitar la formación de 3 a partir de 1, aunque con una eficiencia mucho menor (Fig. 3b, trazo xvii). Solo se observaron los productos 3, 9-11 usando el cofactor F420 en presencia del sistema reductor construido a partir de glucosa 6-fosfato y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (FGD) dependiente de F42043,44,45, pero notablemente ninguna producción de las especies reducidas 7 y 8 (Fig. 3b, trazo xviii). La observación de la incorporación de oxígeno en presencia de F420 y NADH fue inesperada, porque generalmente se ha informado que la 5-deazaflavina reducida reacciona muy lentamente con el oxígeno molecular46,47. Sin embargo, se encontró que los resultados con la compatibilidad del cofactor de flavina que se muestra en la Fig. 3b (trazas xiv-xviii) eran reproducibles (Fig. 27 complementaria). También se descubrió que el NADPH es un cofactor eficaz similar al NADH y, por lo tanto, apoya las reacciones de apertura del anillo de epóxido (Fig. 19 complementaria).

Para explorar la generalidad de esta reacción, se probó una serie de derivados de FST 15‒21 (Fig. 4) como posibles reactivos de oxirano. Aunque FST F (15) es inerte a Alp1U18,33, podría convertirse eficientemente en presencia de FAD y NADH en 1-O-metil-FST C2 (22), 1-O-metil-FST B1 (23), 1-O-metil-FST C3 (24) y 1-O-metil-FST B2 (25) (Fig. 4 y Fig. 28 complementaria), que se caracterizaron estructuralmente mediante análisis espectroscópico de RMN y ECD (Tablas complementarias 7, 8 y Figs. 29-32), así como análisis de difracción de rayos X de cristal único (p. ej., 23, CCDCC 2036400, Tabla complementaria 3).

Los derivados de FST 15‒20 podrían sufrir reacciones de apertura del anillo de epóxido tras el tratamiento con FAD/NADH para producir múltiples productos relacionados con 3, 7, 8 y 9. FST Q (21) no reaccionó con FAD/NADH. Los epóxidos 28-35 no mostraron actividades con FAD/NADH. El tratamiento de auxarthrol H (36) o menadiona 2,3-epóxido (37) con FAD/NADH produjo múltiples productos. Se encontró que los epóxidos 42–46 no reaccionaban con FAD/NADH. La oxidorreductasa RslO5 catalizó una reacción reductora de apertura del anillo epóxido en 43 para producir 44 durante la biosíntesis de rishirilida y se descubrió que la calcona α,β-epóxido (46) era un sustrato de RlsO5 para producir el producto único 47.

De manera similar, 7-O-metil-FST C (16), 6-O-metil-FST C (17), FST D (18), FST S (19) y difluostatina H (DiFST H, 20) también podrían sufrir Reacciones de apertura del anillo de epóxido tras el tratamiento con FAD/NADH para producir un conjunto de productos múltiples relacionados con 3, 7, 8 y 9 (Fig. 4, Figs. complementarias 33‒37). Los productos principales de 16 y 17 se caracterizaron estructuralmente mediante RMN 1D y 2D, así como análisis espectroscópico ECD como FST M (26) 17 y 6-O-metil-FST B1 (27), respectivamente (Fig. 4, Tabla complementaria 9 y Figs. 38, 39). Las estructuras de los otros productos de las reacciones con 18‒20 se dedujeron con base en análisis de LC-MS. En particular, FST Q (21), que difiere de 16 en términos de un hidroxilo C-4 en lugar de un carbonilo C-4, no reaccionó con FAD / NADH (Fig. 40 complementaria), lo que destaca el papel esencial del carbonilo C-4 en esta química.

Los epóxidos 28–37 (Fig. 4) también se probaron como supuestos sustratos de oxirano. No se observaron actividades con 28-35 (Figuras complementarias 41-46)16,40. Por el contrario, el tratamiento de auxarthrol H (36)48 con FAD/NADH condujo a múltiples productos (Fig. 47 complementaria), uno de los cuales se determinó que era 38, que es un análogo estructural de auxarthrol F (Fig. 5; Fig. complementaria 48 y Tabla 10) 49, en comparación con los espectros ECD experimentales y calculados de 36 y 38 (Fig. 49 complementaria). La reacción con menadiona 2,3-epóxido (37) produjo tres productos (Tabla complementaria 11 y Figs. 50-53) que incluyen 3-hidroxi-3-metil-2,3-dihidronaftaleno-1,4-diona (39), 2 -hidroxi-3-metil-1,4-naftoquinona (40, ftiocol, caracterizado por difracción de rayos X, CCDC 2036401; Tabla complementaria 12), y 3-metilnaftaleno-1,4-diona (41).

La reacción puede proceder a través de vías reductoras y oxidativas que conducen a múltiples productos de diferentes estados redox dependiendo de la presencia de NADH y O2. Se propone que las transformaciones clave en las reacciones reductoras (fondo amarillo) involucran un aducto N5‒C4′ de flavina (49) para producir el intermediario enol 13, que puede someterse a tautomerización para producir 7 (principal) u 8 (menor) y oxidación para producir 3 (mayor) o 9 (menor). 7 puede autooxidarse aún más a 12. Mientras que la apertura del anillo oxidativo probablemente involucre un aducto de flavina C4a‒O‒O‒C3′ (50) para dar el intermedio peroxilado 14 (fondo gris), que puede reducirse a 3 y 9 por NADH, y más reordenamientos que conducen a 10 y 11.

Dos características estructurales comunes compartidas por todos los compuestos que pueden reaccionar con FAD/NADH para experimentar las reacciones de apertura del anillo epóxido incluyen (i) la presencia de un carbonilo adyacente al epóxido y (ii) la presencia de un resto aromático adyacente al carbonilo/ par de epóxidos (Fig. 4). La ausencia de un grupo carbonilo vecino al anillo epóxido en 21 y 28–31 puede explicar la falta de reactividad observada. Mientras que 36 y 37 experimentaron la apertura del anillo en presencia de FAD/NADH, no se observó ninguna reacción para 32–35 a pesar de la presencia de un par epóxido/carbonilo en estos compuestos. Esto implica que la conjugación del par carbonilo/epóxido a un sistema aromático también es necesaria para la apertura del anillo del epóxido.

El compuesto comercial vitamina K1 2,3-epóxido (42) también se probó como sustrato putativo, que presenta tanto un par epóxido/carbonilo como un anillo aromático adyacente. Sin embargo, la incubación de 42 con FAD/NADH no produjo cambios en su perfil de retención de TLC ni en sus propiedades espectroscópicas, lo que implica que no hubo reacción (Fig. 54 complementaria). Un estudio reciente demostró que la flavoenzima RslO5 catalizó una reacción de apertura del anillo de epóxido reductor mediada por hidruro para convertir 43 en 44 durante la biosíntesis de rishirilida (Fig. 4)11. La reacción transcurrió de una manera muy similar a la conversión de 1 a 7. Sin embargo, se confirmó que la producción de 44 a partir de 43 dependía estrictamente de RslO5 y 43 no reaccionó en presencia de FMN y NADH11. Una posible explicación es que la presencia de una cadena lateral larga junto al epóxido tanto en 42 como en 43 podría dificultar el enfoque y la orientación de la flavina, lo que impide interacciones adecuadas para la apertura del anillo (Fig. 55 complementaria). Se encontró que dos compuestos comerciales adicionales trans-1,3-difenil-2,3-epoxipropan-1-ona (45) y calcona α,β-epóxido (46) no reaccionaban con FAD/NADH; sin embargo, RlsO5 aceptó 46 pero no 45 como sustrato para producir el producto único 47 (Tabla complementaria 13 y Figs. 56, 57), lo que indica que RslO5 es específico solo para uno de los dos enantiómeros. La incorporación de deuterio en 47 no se observó a partir de la reacción de RslO5 en 2H2O tamponada, pero sí se observó al llevar a cabo la reacción de RslO5 en un ensayo acoplado con la glucosa deshidrogenasa de Bacillus megaterium DSM 2894 (BmGDH) para proporcionar (S)-[4- 2H]NADH50, o con glucosa deshidrogenasa de Thermoplasma acidophilum ATCC 25905 (TaGDH) para proporcionar (R)-[4-2H]NADH51, respectivamente, empleando d-[1-2H]glucosa como donante de deuterio (Fig. 58 complementaria )52. Estudios previos demostraron que el mutante RslO5-H172N tenía una deficiencia en la unión de FMN y era inactivo con el sustrato nativo 4311, lo que sugiere el papel crítico de FMN en la reacción catalizada por RslO5. En conjunto, se propone que un hidruro de FMNH2 procedente de NADH sea el nucleófilo eficaz para las reacciones de apertura de epóxidos catalizadas por RslO5. Por el contrario, no se observó incorporación de deuterio en 7 en las reacciones de 1 y FAD con (S)-[4-2H]NADH o (R)-[4-2H]NADH generado como se describió anteriormente (Figs. 58, 59 complementarias). ). Por lo tanto, la reducción no enzimática de 1 a 7 en presencia de FAD/NADH difiere de la catálisis RslO5 con respecto al origen último del hidrógeno C-3.

Las reacciones de apertura del anillo de epóxido son comunes e importantes tanto en procesos biológicos como en aplicaciones sintéticas1,2. Las reacciones de apertura del anillo de epóxido no enzimáticas son típicamente redox neutras y proceden a través de la adición nucleofílica con la regioselectividad y la estereoselectividad preferidas dependiendo de la naturaleza del epóxido y de las condiciones de reacción para producir generalmente productos con un diol trans-vicinal3,4. Se encuentra una química similar entre las α/β-epóxido hidrolasas que también generan productos de diol transvicinales53. Por ejemplo, la hidrolasa AlpU cataliza la hidrólisis de epóxido del epóxido FST C (1) para producir 2 y 3, cada uno de los cuales presenta un diol transvicinal (Fig. 1)33. Por el contrario, recientemente se informó que la flavoenzima RslO5 cataliza la apertura del anillo epóxido reductor de la rishirilida, lo que produce un producto monohidroxilado11. La química de RslO5 es, por lo tanto, claramente diferente de la de las reacciones hidrolíticas informadas anteriormente y, en cambio, representa la hidrogenación de un epóxido por flavina reducida, lo que es evidente a partir de los resultados que utilizan sustratos marcados isotópicamente (Fig. 58 complementaria).

En este estudio, se muestra que FAD/NADH induce la apertura del anillo de epóxidos adecuadamente activados que conducen a una variedad de productos con diferentes estados redox. En condiciones anaeróbicas, la apertura del anillo de epóxido se produce de forma reductora en presencia de FAD/NADH a través de un mecanismo que puede no estar relacionado con el de la catálisis RslO5. Sin embargo, las especies monohidroxiladas resultantes son muy susceptibles a la oxidación por el oxígeno molecular, lo que da como resultado quinonas (p. ej., 12) y alcoholes vecinales en reacciones que también pueden acelerarse por la presencia de FAD. En condiciones aeróbicas, la apertura del anillo de epóxido parece proceder a través de la formación de una especie α-cetoperoxilada que puede ser reducida por NADH para generar nuevamente dioles vecinales. Alternativamente, el intermedio peroxilado puede sufrir una reorganización adicional que conduce a productos oxidados tanto con el anillo contraído (p. ej., la especie 10 de cinco miembros) como con el anillo expandido (p. ej., la especie 11 de siete miembros).

Sobre la base de la evidencia experimental acumulada, se propone un mecanismo putativo para las reacciones de apertura del anillo de epóxido no enzimáticas habilitadas por FAD/NADH (Fig. 5). Dado que tanto el FAD como el exceso de NADH son necesarios para las reacciones de apertura del anillo de epóxido observadas, se propone el NADH como reductor y el FAD actúa como catalizador redox. Cuando la reacción se lleva a cabo aeróbicamente, se propone que el O2 actúe como oxidante. Dado que el NADH por sí solo no podría iniciar la reacción, se propone que la flavina reducida sea la especie directamente responsable de la reducción de 1. Es posible que 7 se forme directamente a través de una transferencia de hidruro de una especie de flavina reducida (p. ej., N5-H de FADH2) a C3 de 1 abriendo así el anillo de epóxido, que se parecería a la reacción de reducción de epóxido catalizada por RslO5 (Fig. 4). En este caso, la observación de que el producto 7 tiene su H-3 derivado del solvente podría explicarse por el fácil intercambio de N5-H de la flavina reducida con el solvente. Esto implicaría que 7 debería ser el producto de reducción inmediato antes de la tautomerización al intermedio observado 13. Sin embargo, un ensayo de evolución temporal usando 1 0,5 μM con FAD 10 μM y NADH 2 mM demostró que 13 se acumula primero, seguido de la conversión a 7 y 8 Por el contrario, no se observó una acumulación significativa de 13 en incubaciones de 7 en condiciones similares (Fig. 60 complementaria). Estos resultados implican que 13 es el producto de reducción inicial en lugar de 7 u 8 y, por lo tanto, la reducción no enzimática de 1 en presencia de FAD/NADH no procede mediante transferencia directa de hidruro a C-3 como se propone para la catálisis RslO5.

Un mecanismo alternativo implica la activación del oxirano por el carbonilo adyacente acoplado a un anillo aromático y sufre una reducción que conduce a un intermedio inestable. Es poco probable que este intermedio sea 7-desmetil-FST Q (48) (Fig. 4), que es el producto de una reducción directa de carbonilo C-4 en 1, porque el FST Q (21)17 aislado previamente es inerte a la Sistema de reacción FAD/NADH (Fig. 40 complementaria). En cambio, se supone que el intermedio durante la reducción de FST C (1) es una especie de enol como 13, lo que es consistente con la observación de que 13 se tautomeriza fácilmente para producir 7 y 8. Este mecanismo también es consistente con la incorporación de deuterio en H-3 de 7 y 8 cuando la reacción se lleva a cabo en 2H2O. También se espera que el compuesto 13 sea susceptible de autooxidación para producir 3 y 9 de una manera que sea sensible a la presencia de O2, FAD y NADH.

La formación de 13 puede proceder mediante la adición del N-5 nucleofílico de la flavina reducida a 1. Este modelo está respaldado por el hecho de que no se observó formación de 7 usando el cofactor F420 reducido, que carece del N-5 nucleofílico pero es aún puede servir como donante de hidruro54. La adición nucleófila de FADH2 a 1 puede ocurrir en C-3 o C-4. Dada la presencia de un grupo CH3 estéricamente voluminoso en C-3 de 1, se propone que C-4 sea el sitio probable del ataque nucleofílico, lo cual es consistente con el requisito de un carbonilo adyacente al epóxido y, por lo tanto, la diferente reactividad de 16 (carbonilo C-4) frente a 21 (hidroxilo C-4). Teniendo en cuenta que N-5 en FADH2 posee un par solitario, y C-4 en 1 es un carbono carbonilo trigonal, se propone que la reacción redox ocurra a través de una interacción n→π*. Específicamente, el nucleofílico N-5 dona la densidad de electrones del par solitario (n) al centro del carbeno trigonal (orbital π* vacío) a lo largo de la trayectoria de Burgi-Dunitz55. La mezcla de estos orbitales es termodinámicamente favorable y da como resultado un aducto covalente 49 (Fig. 5)56. La posterior desprotonación N-1 del resto flavina en 49 conduce a la ruptura del enlace N5‒C4' y la liberación de la flavina oxidada, completando así la reducción de 1 al intermedio enol 13 con un doble enlace Δ3,4 (Fig. 5 ).

El intermedio 13 es altamente inestable y sufre una fácil tautomerización para incorporar un hidron solvente en el carbono α (C-3), ya sea desde la cara si (la ruta principal) o la cara re (la ruta secundaria) de la estructura plana sp2, para rendimiento 7 u 8, respectivamente57. Este mecanismo es consistente con la incorporación específica del sitio de deuterio en C-3 en 7 y 8 del 2H2O tamponado (Fig. 3a). A pesar de la configuración 2,3-cis de 7 en comparación con 8, el primero parece ser el tautómero favorecido termodinámicamente con una constante de equilibrio de aproximadamente [7] eq/[8] eq = 5,4 (Fig. 61 complementaria). Además, 7, 8 y el intermediario enol putativo 13 también son susceptibles de autooxidación para producir 12 (Fig. 62 complementaria).

El intermediario enol putativo 13 también parece ser sensible al oxígeno molecular y puede sufrir autooxidación en presencia de FAD y NADH. Se sabe que la flavina reducida reacciona con O2 para formar el aducto covalente Fl4aOOH (FAD → FADOOH)58 y, en algunos casos, se puede liberar H2O2 de FADOOH para que actúe como oxidante37,59. Sin embargo, ni 1 ni 13 pueden reaccionar con H2O2 (Figuras complementarias 24, 63). Por lo tanto, se propone que el intermedio 13 reaccione con el grupo hidroperoxi C (4a) electrofílico de FADOOH para producir los productos monooxigenados C-3 (consulte la Fig. 64 complementaria). La hidroxilación puede ocurrir ya sea desde la cara si (ruta principal) o la cara re (ruta menor) del doble enlace plano (Δ3,4) para producir 3 o 9, respectivamente, con la liberación concomitante de la flavina oxidada (Fig. 5) . El mecanismo propuesto está respaldado por las observaciones de que (i) el O incorporado tanto en 3 como en 9 en C-3 se origina en O2, y (ii) la conversión de 13 a 3 y 9 requiere la presencia de FAD, NADH y O2.

El aislamiento del intermedio 14 indica que 3 y 9 también se pueden producir de una forma alternativa que no implica 13. En presencia de oxígeno molecular, el peróxido de flavina C(4a) (FADOO‒) puede servir como nucleófilo para atacar regioselectivamente C-3 de 1 en la cara si (ruta principal) o en la cara re (ruta menor) para abrir el anillo de epóxido, dando como resultado el aducto putativo 50 (Fig. 5). La presencia del oxígeno del carbonilo C-4 con efecto de extracción de electrones puede causar cambios en la densidad electrónica de C-360, para hacer que C-3 sea un mejor sitio para las sustituciones de nucleófilos que C-2 del epóxido en 1. Desprotonación del flavin N-5 en 50 rompe el enlace covalente C4a‒O para liberar 14 y FAD (Fig. 5). El producto 14 es una mezcla de isómeros C-3 y se reduce fácilmente a 3 y 9 por NADH (Fig. 5, Fig. 65 complementaria). La coincubación de 14 con NADH también conduce a 10 y 11, que se propone implicar un mecanismo similar a la reacción de Baeyer-Villiger. El hidroperóxido C-3 en 14 puede realizar una adición nucleófila intramolecular en el carbonilo C-4 para formar el intermediario putativo 51, que puede dividirse para generar 10 y 11. En el primer caso, el intermediario 51 puede sufrir un reordenamiento de Criegee para producir un anillo de lactona de siete miembros61,62, seguido de una adición de mordida intramolecular del hidroxi C-1 en el carbonilo C-4 que conduce a 10 después de la deshidratación (Fig. 5)63. Alternativamente, la unidad de 1,2-dioxetano de 51 puede sufrir una escisión heterolítica, seguida de una fragmentación tipo Grob para producir un intermedio de oxoheptanoato64,65, que finalmente genera el hemiacetal 11 después de sucesivas ciclaciones intramoleculares y deshidratación66.

En conclusión, se sugiere que la apertura del anillo de epóxido reductor proceda mecánicamente a través de un aducto transitorio (49) con un enlace covalente N5‒C4' que se forma entre N-5 del cofactor de flavina y C-4 del sustrato FST C ( 1) (figura 5). Si bien la tautomerización del producto resultante puede generar 7 y 8, la reacción nucleofílica con FADOOH también puede generar los productos diol 3 y 9. La apertura del anillo de epóxido oxidativo de 1 produce el intermedio 14 a través de un aducto covalente putativo C4a‒O‒O‒C3' ( 50, figura 5). La reactividad canónica de los cofactores de flavina involucra la química redox a través de la transferencia de hidruro N-5 o la activación de oxígeno en C-4a en la mayoría de los casos67. Sin embargo, se ha informado que algunas flavoenzimas catalizan la formación de aductos de sustrato covalentes de flavina N-5 de una manera redox neutral68, con ejemplos que incluyen los aductos de iminio en el ciclo catalítico de UDP-galactopiranosa mutasa69, alquil-dihidroxiacetona fosfato sintasa70 , flavina preniltransferasa71, timidilato sintasa72 y 2-haloacrilato hidratasa73.

El presente estudio proporciona un ejemplo que probablemente involucre la formación del aducto N-5 de flavina durante reacciones no enzimáticas catalizadas por flavina (Fig. 5). Además, además de servir como nucleófilo en la mediación de la hidroxilación, la epoxidación y la oxidación de Baeyer-Villiger en la catálisis de flavoenzimas58, se propone que el peróxido de flavina C(4a) (FADOO‒) también facilite la formación de intermediarios peroxilados como el 14 (Fig. 5). Se sabe que la flavina y sus derivados participan como cofactores en una amplia variedad de reacciones que se encuentran en la naturaleza67,74. Informes anteriores han demostrado que las flavinas naturales pueden catalizar la descarboxilación oxidativa no enzimática de derivados del ácido picolínico75 y la yodación no enzimática de diversos compuestos aromáticos37,59. En este estudio, la química de las flavinas se expande a las reacciones de apertura del anillo de epóxido tanto de manera reductora como oxidativa para generar múltiples productos de anillo abierto. En consecuencia, la química de la flavina identificada en este estudio puede aplicarse a otros epóxidos y, por lo tanto, promete ser una herramienta útil en la síntesis orgánica.

Para el aislamiento de FSTs15 se utilizó la cepa Micromonospora rosaria SCSIO N160. FST Q (21) se aisló previamente de Streptomyces sp. PKU-MA0004517. Los productos químicos, enzimas y otros reactivos biológicos moleculares se compraron de fuentes comerciales estándar y se usaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

El análisis HPLC de las reacciones se llevó a cabo generalmente en un instrumento de la serie Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies Inc., EE. UU.) utilizando una columna C18 de fase inversa (Kinetex® 5 µm C18 100 Å, columna LC 150 × 4,6 mm, Phenomenex, EE. UU.) o una columna polar (Comixsep®, P/N FMG-BPF5-EONU, Polar BiPFP 5 u, 250 × 4,6 mm, China) con detección UV a 256 o 304 nm bajo el siguiente programa: disolvente A, 10 % de acetonitrilo (MeCN) en agua suplementada con ácido fórmico al 0,1%; disolvente B, 90 % de MeCN en agua; 5 % B a 80 % B (0–20 min), 80 % B a 100 % B (20–21 min), 100 % B (21–24 min), 100 % B a 5 % B (24–25 min ), 5% B (25–30 min); velocidad de flujo a 1 mL min−1.

El fragmento de ADN de rslO5 (GenBank: KJ437438.1 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1]) del grupo de genes biosintéticos de rishirilida en Streptomyces bottropensis11 se sintetizó y clonó en pET28a para producir el plásmido pCSG8112 (Tabla complementaria S14). Cuando los cultivos de E. coli BL21(DE3)/pCSG8112 en medio LB que contenía kanamicina (50 μg mL−1) se cultivaron hasta una DO600 de aproximadamente 0,6 a 37 °C, se indujo la producción de RslO5 mediante la adición de isopropil- β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,1 mM. Los cultivos se cultivaron a 16 °C durante 12 h más. A continuación, las células se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en el tampón de lisis (Tris-Cl 20 mM, NaCl 500 mM e imidazol 5 mM, pH 8,0) para sonicación. La purificación de RslO5 marcada con N-His6 se realizó mediante cromatografía de afinidad con Ni-NTA de acuerdo con el manual del fabricante (Novagen, EE. UU.). Después de desalar con la columna PD-10 (GE Healthcare, EE. UU.), la RslO5 purificada se almacenó en el tampón de almacenamiento (glicerol al 10 %, DTT 1 mM, Tris-Cl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0) a -80 °C. para un uso posterior. La expresión y purificación de Fre34, Alp1U18, FlsH18, XiaK38, TiaM36 y FlsO235 se realizaron de manera similar a la descrita para RslO5. Los ensayos enzimáticos in vitro estándar (Alp1U, FlsH, Fre, XiaK, TiaM, Fre o FlsO2) contenían FST C 100 μM (1) y 10 μM de enzima recombinante purificada en tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) 50 mM (pH 7,0). ) en un volumen total de 100 μL con incubación a 30 °C durante 0,5‒2 h. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 100 μL de MeOH enfriado con hielo y se controlaron utilizando los métodos HPLC analíticos generales.

Una mezcla de reacción típica incluía 1 100 µM, FAD 100 µM y NADH 10 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 µL con incubación a 30 °C durante 0,5‒2 h. En general, las reacciones se terminaron añadiendo 100 μL de MeOH enfriado con hielo y se analizaron por HPLC utilizando el método HPLC analítico general o se sometieron a análisis LC-MS. Para las reacciones en condiciones anaerobias, los tampones de reacción se enjuagaron con N2 durante 5 min antes de agregar 1, se taparon con Parafilm y se enjuagaron con N2 durante la incubación a 30 °C durante 30 min. Para las reacciones en condiciones aeróbicas, los tampones de reacción se enjuagaron con O2 durante 5 min antes de agregar 1, se taparon con Parafilm y se enjuagaron con O2 durante la incubación a 30 °C durante 30 min. Para las reacciones de marcado de isótopos con 2H, cada reacción se llevó a cabo en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) preparado con agua deuterada (2H2O). Para las reacciones de marcado de isótopos con 18O2, se desgasificó una mezcla de reacción que contenía FAD 100 µM y NADH 10 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) y se lavó con 18O2 durante 5 min; después de la adición de 100 µM 1, se burbujeó continuamente gas 18O2 en la mezcla de reacción durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación ocasional.

Para determinar los efectos del pH en las reacciones, los ensayos se realizaron en un volumen total de 100 μL que contenía 1 100 μM, FAD 100 μM y NADH 10 mM en tampones 50 mM con valores de pH que oscilaban entre 3 y 10 con incubación a 30 °C. durante 2 h. Los tampones se prepararon de la siguiente manera: tampón ácido cítrico/Na2HPO4 (pH 3-6); tampón PBS (pH 7); tampón de ácido bórico/bórax (pH 8‒9), tampón de bórax/NaOH (pH 10). Como controles, se incubó 1 100 μM en diferentes tampones de pH (pH 3-10) en presencia de FAD 100 μM solo (o NADH 10 mM solo) a 30 °C durante 2 h.

Para el ensayo de evolución temporal, las reacciones se realizaron incubando 1 100 µM, FAD 100 µM y NADH 10 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) a 30 °C con muestreo en diferentes puntos temporales de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25 y 30 min. Para ensayar los efectos de diferentes concentraciones de FAD/NADH, se llevaron a cabo reacciones con tampón PBS 100 µM 1 en 50 mM (pH 7,0) con concentraciones variables de FAD y NADH. El primer conjunto de reacciones se realizó con 1 100 μM, FAD 1 μM y 2 (o 5 o 10 mM) de NADH. El segundo conjunto de reacciones se realizó con 1 100 μM, FAD 10 μM y NADH 2 (o 5 o 10) mM. El tercer conjunto de reacciones se llevó a cabo con 1 100 μM, FAD 100 μM y NADH 2 (o 5 ó 10) mM. Las mezclas de reacción se incubaron en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) a 30 °C durante 30 min.

Para probar la compatibilidad del cofactor, los ensayos que contenían 100 μM de FAD 1, 100 μM (o FMN/riboflavina/isoaloxazina) y NADH 10 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 μL se incubaron a 30 °C durante 30 minutos. Para probar F420 como cofactor, los ensayos contienen 100 μM de 1, 200 μM de F420, glucosa-6-fosfato 2,5 mM, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (FGD) dependiente de F420 10 μM en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). ) en un volumen total de 100 μL se incubaron a 30 °C durante 1 h.

Las reacciones de apertura del anillo de epóxido mediadas por FAD/NADH se probaron con varios sustratos, incluidos los sustratos relacionados con FST 15‒21 y los sustratos no relacionados con FST 28–37, 42, 45 y 46. Una mezcla de reacción típica contiene 100 µM de sustrato (15 ‒21, 28–37, 42, 45 o 46), FAD 100 µM y NADH 10 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 µL.

Para probar la reactividad de H2O2 con FST C (1), los ensayos se realizaron en un volumen total de 100 μL que contenía 100 μM 1 y H2O2 al 30 % en tampones 50 mM a pH 3,0 (o pH 7,0 o pH 10,0) mediante incubación a 30 °C durante 2 h.

Se realizó una reacción escalada de 1 en un volumen total de 1 L en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) que contenía 1 100 μM, NADH 10 mM y FAD 100 μM a 30 °C durante 2 h con agitación ocasional. La reacción se extinguió mediante la adición de un volumen igual de butanona helada y se centrifugó a 2057 × g durante 20 min a 4 °C. A continuación, las mezclas de reacción se extrajeron tres veces con un volumen igual de butanona y los disolventes se eliminaron al vacío en un baño de hielo. Los extractos crudos se disolvieron en 1,5 ml de MeOH y se sometieron a HPLC semipreparativa utilizando una columna Agilent Eclipse XDB-C18 (250 mm × 9,4 mm, 5 μm; Agilent Technology Ltd., EE. UU.) con un gradiente de elución isocrático de 70 % A (H2O con ácido fórmico al 0,8 %) y B al 30 % (MeCN) a un caudal de 2,5 mL min−1. Así, los compuestos 3 (8,5 mg, 22,0%), 7 (22,0 mg, 57,0%), 8 (6,0 mg, 15,5%), 9 (2,6 mg, 6,7%), 10 (1,6 mg, 4,1%) y Se obtuvieron 11 (3,4 mg, 8,8%). De manera similar, una escala de reacción de 40 ml con FST F 100 μM (2) proporcionó 22 (2,0 mg, 15 %), 23 (6,0 mg, 46,0 %), 24 (0,9 mg, 7,0 %) y 25 (1,2 mg, 9,0%). Las reacciones a escala de 30 ml de 16, 17 o 36 produjeron 26 (1,3 mg, 44,0 %), 27 (1,5 mg, 46,0 %) o 38 (1,3 mg, 67,0 %), respectivamente. Una reacción a escala de 30 ml de 37 produjo 39 (1,8 mg, 11,0 %), 40 (4,8 mg, 30,0 %) y 41 (4,3 mg, 27,0 %).

Para el aislamiento de 3-18O y 9-18O, se llevó a cabo una reacción de escala 1 de 400 mL bajo 18O2, que constaba de 1 100 µM, FAD 100 µM y NADH 10 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) por incubación. a 30 °C durante 2 h. Los productos de reacción se purificaron mediante HPLC semipreparativa como se describe anteriormente para proporcionar 3-18O (3,0 mg, 33,0 %) y 9-18O (1,2 mg, 16,0 %). Para el aislamiento de 7-2H y 8-2H, se preparó una reacción a escala de 400 mL de marcaje isotópico con 2H en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) preparado con 2H2O tamponado, que contenía 1 100 µM, FAD 100 µM, y NADH 10 mM, por incubación a 30 °C durante 2 h. Los productos de reacción se purificaron mediante HPLC semipreparativa para proporcionar 7-2H (11,5 mg, 65,0 %) y 8-2H (3,2 mg, 19,0 %).

Una mezcla de reacción que contenía 1 100 µM, FAD 10 µM y NADH 2 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 µL se incubó en una atmósfera normal a 30 °C durante 20 min. Las reacciones se extinguieron mediante la adición de 100 μL de MeOH enfriado con hielo. Para comprobar la estabilidad de 13, el intermedio 13 se recogió de una serie de HPLC analítica general y se reinyectó inmediatamente para el análisis de HPLC. De forma similar, para controlar los cambios de 13 en diversas condiciones, el 13 recién recogido se incubó inmediatamente en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) que contenía (i) FAD 10 µM; (ii) 30% H2O2; (iii) NADH 2 mM; (iv) FAD 10 µM y NADH 2 mM (en presencia de exceso de O2) a 30 °C durante 30 min. Las reacciones se extinguieron mediante la adición de 100 μl de MeOH enfriado con hielo y se controlaron mediante el método HPLC analítico general utilizando una columna C18 y una columna polar.

Se realizaron reacciones ampliadas en un volumen total de 50 ml (100 µL × 500 tubos Eppendorf) que contenían 1 100 µM, FAD 10 µM y NADH 2 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) a 30 °C durante 20 min con el objetivo de aislar 13 para la elucidación de la estructura. Las reacciones en cada tubo Eppendorf se detuvieron extrayendo tres veces con 100 μL de butanona helada y los solventes se eliminaron al vacío en un baño de hielo. A continuación, los extractos brutos se recogieron y disolvieron en 1,0 ml de MeOH y se sometieron a HPLC analítica general utilizando una columna polar. Las colecciones se mantuvieron a -80 °C antes de la liofilización. Las fracciones recolectadas se purificaron por segunda vez para eliminar 7, que se había generado a partir de la descomposición de 13. Este proceso finalmente proporcionó un compuesto puro y estable (0,8 mg), que se disolvió en DMSO-d6 para el análisis de RMN y se confirmó que era 14

Se realizó un conjunto de ensayos para comprobar la estabilidad de 14. Una mezcla de reacción típica incluía 14 100 µM, FAD 10 µM y NADH 2 mM en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 µL. Las reacciones de control se realizaron en paralelo omitiendo FAD o NADH en los ensayos. También se realizó la coincubación de 14 100 µM en H2O2 al 30% en un volumen total de 100 µL. Las mezclas de reacción se incubaron a 30 °C durante 30 min. Las reacciones se extinguieron después de agregar 100 μL de MeOH enfriado con hielo y se analizaron por HPLC utilizando una columna polar siguiendo el método HPLC analítico general.

Una mezcla de reacción in vitro estándar de RslO5 contenía 100 μM de trans-1,3-difenil-2,3-epoxipropan-1-ona (45) o α,β-epóxido de chalcona (46), 10 μM de RslO5 y 5 mM de NADH en 50 Tampón PBS mM (pH 7,0) en un volumen total de 100 μL e incubado a 30 °C durante 2 h. La reacción con 46 también se realizó en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) preparado con agua deuterada (2H2O) y se sometió a análisis LC-HRESIMS para investigar la incorporación de 2H en 47 desde el disolvente. Para aislar 47 para la elucidación estructural, se realizaron reacciones de 15 mL en tampón PBS 50 mM (pH 7,0) que contenía 46 100 μM, RslO5 10 μM y NADH 5 mM a 30 °C durante 6 h. La reacción se inactivó con un volumen igual de butanona previamente enfriada. Después de centrifugar a 2057 × g durante 20 min a 4 °C, los sobrenadantes se extrajeron tres veces con un volumen igual de butanona preenfriada. La butanona se eliminó al vacío en un baño de hielo. Los extractos crudos se disolvieron en 500 μL de MeOH y se purificaron por HPLC semipreparativa utilizando una columna C18 (250 mm × 10,0 mm, 5 μm; Phenomenex, EE. UU.), con un gradiente de elución isocrático de 60 % A (H2O con 0,8 % de ácido fórmico)/40 % B (MeCN) a un caudal de 2,5 ml min−1 para producir 47 (3,0 mg, 41,0 %).

La purificación de las d-glucosa deshidrogenasas BmGDH de Bacillus megaterium DSM 2894 en E. coli BL21(DE3)/pRSF-BmGDH y TaGDH de Thermoplasma acidophilum en E. coli BL21(DE3)/pCSG3622, se llevó a cabo de acuerdo con nuestro estudio previo76. En el caso de los ensayos de acoplamiento RslO5/GDH, la reducción de NADP a NADPH se realizó primero en una reacción de 100 μL que contenía 10 μM de TaGDH (o BmGDH), 2 mM de NADP y 100 mM de [1-2H]d-glucosa en 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) mediante incubación durante 1 h a 37 °C para BmGDH o 50 °C para TaGDH, seguido de la adición de 46 100 μM y RslO5 10 mM y una incubación adicional a 30 °C durante 6 h. El NADH marcado con 2H generado in situ también se hizo reaccionar con 1 y FAD para monitorear la incorporación de 2H en el producto 7. Las reacciones se extinguieron con un volumen igual de MeOH enfriado con hielo y se analizaron por LC-HRESIMS utilizando el método analítico general. método HPLC.

Se realizaron búsquedas conformacionales mixtas torsional/modo bajo mediante el software Macromodel 10.8.011 utilizando el MMFF con un modelo solvente implícito para CHCl3 aplicando una ventana de energía de 21 kJ/mol77. Las reoptimizaciones de geometría de los conformadores resultantes se llevaron a cabo al nivel de ωB97X/TZVP con el modelo de solvente PCM para MeCN. Los cálculos de TDDFT ECD se realizaron con Gaussian 09 para ECD usando varios funcionales (B3LYP, BH&HLYP, CAM-B3LYP, PBE0) y la base TZVP establecida con el mismo modelo de solvente que en el paso de optimización DFT anterior78. Los espectros ECD se generaron como la suma de gaussianas con anchos de media altura de 3000 y 3600 cm−1, utilizando valores de fuerza de rotación calculados por velocidad de dipolo79. Las distribuciones de Boltzmann se estimaron a partir de las energías ωB97X. Se utilizó el paquete de software MOLEKEL para la visualización de los resultados80.

Se obtuvo un monocristal de 7, 10 y 23 en una mezcla de disolventes de MeOH y agua, y monocristales de 40 en una mezcla de disolventes de CH3CN y H2O. Se seleccionaron los cristales adecuados y los datos de los cristales se registraron en un difractómetro simple XtaLAB AFC12 (RINC): Kappa, con radiación Cu Kα (λ = 1.541 84 Å). Los cristales se mantuvieron a 99,9(7) K durante 7, 99,8(9) K durante 23, 100,00(10) K durante 10 y 100,01(12) K durante 40 durante la recopilación de datos. Usando Olex281, la estructura se resolvió con el programa de solución de estructura ShelXT82 usando la fase intrínseca y se refinó con el paquete de refinamiento ShelXL usando la minimización de mínimos cuadrados.

Los datos y el código de este manuscrito se han depositado correctamente en un depósito de datos públicos o se han proporcionado en la información complementaria para disponibilidad pública. Los datos cristalográficos se pueden obtener de forma gratuita para 7 (CCDC 2036399), 10 (CCDC 2129081), 23 (CCDC 2036400) y 40 (CCDC 2036401) a través de www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif, o por enviando un correo electrónico a [email protected], o poniéndose en contacto con el Centro de datos cristalográficos de Cambridge, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, Reino Unido; fax: +44 1223 336033. El número de acceso de GenBank para el fragmento de ADN de rslO5 es KJ437438.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1).

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Este trabajo es apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31820103003 a CZ, 42176127 a WZ, 41676165 a WZ, 31630004 a CZ y 31700042 a CY); Proyecto clave de ciencia y tecnología de la provincia de Hainan (ZDKJ202018 a CZ); LA MAYORÍA (2018YFA0901903 a YZ); Fundación de Educación KC Wong (GJTD-2020-12 a CZ); el Fondo Especial Provincial de Guangdong para el Proyecto de Desarrollo Económico Marino (GDNRC[2021] 48 a CZ); Laboratorio de Ciencia e Ingeniería Marinas del Sur de Guangdong (Guangzhou) (GML2019ZD0406 a CZ); Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil CAS (2022349 a CY) y el Proyecto de Planificación de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (202102020471 a CY). BCD agradece el apoyo de la beca de doctorado del presidente de CAS-TWAS. H.-wL agradece el apoyo de Welch Foundation (F-1511). GB cuenta con el apoyo de una beca Sir Charles Hercus a través del Consejo de Investigación en Salud de Nueva Zelanda. Agradecemos al profesor Keqiang Fan del Instituto de Microbiología de la Academia de Ciencias de China por la generosa donación del compuesto 30. Nos gustaría agradecer al profesor Tadhg Begley de la Universidad Texas A&M por su útil debate. Agradecemos al Dr. ZH Xiao, XH Zheng, AJ Sun, Y. Zhang y X. Ma en el centro de servicio público de equipos en SCSIO por registrar datos espectroscópicos. También agradecemos el soporte de archivo de datos del Centro Nacional de Datos del Sistema Terrestre, Infraestructura Nacional de Ciencia y Tecnología de China (http://www.geodata.cn).

Estos autores contribuyeron igualmente: Bidhan Chandra De, Wenjun Zhang.

Laboratorio clave de biorecursos marinos tropicales y ecología, Guangdong Laboratorio clave de materia médica marina, Instituto de Oceanología del Mar del Sur de China, Academia de Ciencias de China, Guangzhou, 510301, China

Bidhan Chandra De, Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Chunshuai Huang, Liping Zhang, Wei Liu, Yiguang Zhu y Changsheng Zhang

Universidad de la Academia China de Ciencias, 19 Yuquan Road, Beijing, 100049, China

Bidhan Chandra De, Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Liping Zhang, Yiguang Zhu y Changsheng Zhang

Laboratorio de ciencia e ingeniería marina del sur de Guangdong (Guangzhou), 1119 Haibin Road, distrito de Nansha, Guangzhou, 511458, China

Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Liping Zhang, Yiguang Zhu y Changsheng Zhang

Instituto Sanya de Ingeniería Ecoambiental Oceánica, Bahía Científica de Yazhou, Sanya, 572000, China

Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Yiguang Zhu y Changsheng Zhang

Departamento de Química Orgánica, Universidad de Debrecen, PO Box 400, H-4002, Debrecen, Hungría

Atila Mandi y Tibor Kurtán

División de Biología Química y Química Medicinal, Facultad de Farmacia y Departamento de Química, Universidad de Texas en Austin, Austin, TX, 78712, EE. UU.

Mark W. Ruszczycky y Hung-wen Liu

Laboratorio Estatal Clave de Medicamentos Naturales y Biomiméticos, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Pekín, 38 Xueyuan Road, Distrito de Haidian, Pekín, 100191, China

ming ma

Laboratorio de Bioquímica Molecular y Microbiana, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Auckland, Auckland, Nueva Zelanda

Ghader Bashiri

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BCD, WZ, CY, HC, LP y WL realizaron reacciones de apertura de epóxidos, aislamiento de compuestos y determinación de estructuras. AM y TK realizaron los cálculos de ECD. MM y GB contribuyeron con compuestos y reactivos clave. BCD, WZ, MWR, YZ, TK, HwL y CZ analizaron los datos y escribieron el manuscrito. CZ y HwL dirigieron la investigación. BCD y WZ contribuyeron igualmente a este trabajo.

Correspondencia a Hung-wen Liu o Changsheng Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Xudong Qu y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

De, BC, Zhang, W., Yang, C. et al. Reacciones de apertura del anillo de epóxido reductivas y oxidativas habilitadas por flavina. Nat Comun 13, 4896 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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Recibido: 09 Abril 2022

Aceptado: 08 agosto 2022

Publicado: 20 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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